Технологія одержання ферментних препаратів

Класифікація ферментів основана на механізмі їхньої дії й включає 6 класів. Ферменти – біокаталізатори володіють рядом унікальних властивостей, наприклад, таких як висока каталітична активність і вибірковість дії. У ряді випадків ферменти мають абсолютну специфічність, каталізуючи перетворення тільки однієї речовини. Для кожного ферменту існує свій оптимум рН, при якому його каталітична дія максимальна. При різкій зміні рН ферменти інактивуються шляхом необоротної денатурації. Прискорення реакції при підвищенні температури також лімітовано певними межами, оскільки вже при температурі 40 – 50°С багато ферментів денатурують. Ці властивості ферментів доводиться враховувати при розробці технології нового препарату.

Оскільки ферменти – речовини білкової природи, у суміші з іншими білками їх кількість визначити практично неможливо. Наявність ферменту в препараті може бути встановлена лише за протіканням тієї реакції, яку каталізує фермент. При цьому кількісну оцінку вмісту ферменту можна дати, визначивши або кількість продуктів реакції, які утворилися, або кількість субстрату, що витратився. За одиницю активності ферменту приймають ту його кількість, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату за 1 хвилину при заданих стандартних умовах – стандартна одиниця активності.

За рішенням Міжнародного біохімічного союзу активність вирішено визначати при t = 30°С за початковою швидкістю реакції, коли концентрація насичення ферменту й тимчасова залежність близька до кінетики реакції нульового порядку. Інші параметри реакції індивідуальні для кожного ферменту. Активність препарату, який випускається – найважливіший нормований показник якості.

Основну частину ферментів, які одержують промисловим способом, становлять гідролази. До них відносяться, у першу чергу амілолітичні ферменти: α-амілаза, β-амілаза, глюкоамілаза. Їхня основна функція – гідроліз крохмалю й глікогену. Крохмаль при гідролізі розщеплюється на декстрини, а потім до глюкози. Ці ферменти застосовуються в спиртовій промисловості, хлібопеченні.

Протеолітичні ферменти належать до класу пептидгідролаз. Їх дія полягає в прискоренні гідролізу пептидних зв'язків у білках і пептидах. Важлива їхня особливість – селективний характер дії на пептидні зв'язки в білковій молекулі. Наприклад, пепсин діє тільки на зв'язок з ароматичними амінокислотами, трипсин – на зв'язок між аргініном і лізином. У промисловості протеолітичні ферменти класифікують за здатністю проявляти активність у певній області рН: рН 1,5 – 3,7 – кислі протеази; рН 6,5 – 7,5 – протеази; pН > 8.0 – лужні протеази.

Протеази знаходять широке застосування в різних галузях промисловості: м'ясна – для пом'якшення м'яса; шкіряна – пом'якшення шкір; кіновиробництво – розчинення желатинового шару при регенерації плівок; парфумерна – добавки в зубну пасту, креми, лосьйони; виробництво миючих засобів – добавки для видалення забруднень білкової природи; медицина – при лікуванні запальних процесів, тромбозів і т.д.

Пектолітичні ферменти зменшують молекулярну масу й знижують в'язкість пектинових речовин. Пектинази діляться на дві групи – гідролази й транселімінази. Гідролази відокремлюють метильні залишки або розривають глікозидні зв'язки. Транселімінази прискорюють негідролітичне розщеплення пектинових речовин з утворенням подвійних зв'язків. Застосовуються в текстильній промисловості (вимочування льону перед переробкою), у виноробстві – висвітлення вин, а також при консервуванні фруктових соків.

Целюлолітичні ферменти дуже специфічні, їхня дія проявляється в деполімеризації молекул целюлози. Використовуються у вигляді комплексу, який здійснює гідроліз целюлози до глюкози (у гідролізній промисловості). У медичній промисловості їх використовують для виділення стероїдів з рослин, у харчовій – для поліпшення якості рослинних масел, у сільському господарстві – як добавки в комбікорми для жуйних тварин.

Існує ряд факторів, які впливають на біосинтез ферментів. У першу чергу, до них відноситься генетичний. Склад і кількість синтезованих ферментів спадково детерміновані. Застосовуючи мутагени можна змінити генетичні властивості мікроорганізмів й одержати штами з необхідними для промисловості властивостями. До мутагенних факторів відносяться іонізуюче й неіонізуюче випромінювання, ізотопи, антибіотики, інші хімічні сполуки, які перетворюють спадкоємні елементи клітини. Незважаючи на визначальну роль генетичного фактора в біосинтезі ферментів, продуктивність біотехнологічних процесів залежить і від складу поживного середовища При цьому важливим є не тільки наявність джерел основних поживних речовин, але й речовин, що відіграють роль індукторів або репресорів біосинтезу даного конкретного ферменту або його груп. Механізм цього явища ще не цілком вивчений, але сам факт повинен ураховуватися при виборі технології.

Розглянемо кілька прикладів. Фермент ліпаза майже не синтезується грибом Aspergillus awamori на середовищі без індуктора, додавання жиру кашалота підсилює біосинтез ферменту в сотні разів. При додаванні ж у середовище крохмалю й при повному видаленні мінерального фосфору інтенсивно синтезується фосфатаза. Не тільки наявність індуктора здатна збільшувати вихід ферменту. Важливу роль відіграє склад поживного середовища й умови культивування. При розробці процесу біосинтезу α-амілази культурою Aspergillus oryzae заміна сахарози (як джерела вуглецю) на крохмаль збільшила активність ферменту в 3 рази, додавання солодового екстракту (із пророслого насіння злакових) ще в 10 разів, а підвищення концентрації основних елементів поживного середовища на 50% – ще в 2 рази.

Для інтенсифікації процесу росту й синтезу ферментів додають різні фактори росту, наприклад, амінокислоти, пуринові основи та їх похідні, РНК і продукти їх гідролізу. Як джерело вуглецю використовують крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати біомаси дріжджів. Мікроорганізми можуть утилізувати й мінеральні джерела азоту. До складу поживного середовища входять й іони Mg, Mn, Zn, Fe, Cu й ін. метали. Механізм дії більшості з них невідомий. Деякі входять до складу ферменту. Іони Ca підвищують стійкість α-амілази, іони Fe й Mg активізують і стабілізують протеолітичні ферменти.

Оптимальний склад поживного середовища для кожного продуцента може бути визначений двома способами: емпіричним і побудовою математичної моделі з використанням комп'ютера. Останній, природно, переважніше. За характером культивування всі технологічні процеси виробництва ферментних препаратів діляться на дві групи: глибинний і поверхневий методи.

Глибинний метод виробництва ферментів. У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі Технічно цей метод більш досконалий, ніж поверхневий, тому що легко піддається автоматизації й механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні зазвичай значно нижча, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як й у будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.

1. Готування поживного середовища залежить від складу компонентів. Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для готування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня забрудненості сторонніми мікроорганізмами об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації й апарати. Повітря очищається до й після аерування. До початку, тому що містить частки пилу органічної й неорганічної природи, після – тому що несе клітини продуцента.

2. Одержання засівного матеріалу. Для засівання поживний матеріал середовища готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій – молода ростуча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу складається в збільшенні маси продуцента в 3 – 4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується тільки вегетативно, він різко росте (до 5 – 20%). Якщо ж відбувається швидке спороутворення – скорочується до 1%.

3. Виробниче культивування. Біосинтез ферментів у глибинній культурі протікає протягом 2 – 4 діб при безперервній подачі повітря й перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах може гальмувати ріст біомаси продуцента, тому часто свіже середовище або деякі його компоненти вводяться у ферментер на стадії активного росту. Температурний оптимум перебуває в інтервалі 22 – 32°С. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості метаболітів, що утворилися, і концентрації клітин. Дані надходять у комп'ютер, що визначає стратегію корекції процесу й автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкраща якість продуктів.

4. Виділення. У міцелії тридобової культури залишається не більше 15% ферментів. Інші виділяються в навколишні клітини або рідке середовище. У цьому випадку препарати ферментів виділяють із фільтратів після відділення біомаси.

5. Одержання товарної форми.

Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів. При поверхневому методі культура росте на поверхні твердого зволоженого поживного середовища Міцелій повністю обволікає й досить міцно скріплює тверді частки субстрату, з якого одержує поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середовище повинно бути пухким, а шар культури-продуцента невеликим.

Вирощування виробничої культури відбувається в асептичних умовах, але середовище й кювети необхідно стерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування.

Переваги поверхневої культури: значно більша висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрюванні крохмалю 5 кг поверхневої культури заміняють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.

Посівний матеріал може бути трьох видів:

– культура, що виросла на твердому поживному середовищі;

– споровий матеріал;

– міцеліальна культура, вирощена глибинним способом.

У три етапи одержують і посівну культуру. Спочатку вихідну культуру продуцента висівають на 1 – 1,5 г зволожених стерильних пшеничних висівках у пробірці й вирощують у термостаті до надлишкового спороутворення. Другий етап – аналогічний, але в колбах, третій – у судинах з 500 г середовища.

Основа складу поживного середовища – пшеничні висівки – джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до них можна додавати бурячний гніт, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середовище водяною парою при помішуванні (температура – 105 – 140°С, час 60 – 90 хвилин). Після цього середовище засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають у ростові камери. Культивують протягом 36 – 48 годин.

Ріст ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набрякання конідій й їхнє проростання (температура не нижче 28°С), потім ріст міцелію у вигляді пушка сірувато-білого кольору (необхідно виводити надлишкове тепло) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту й розвитку продуцента необхідні аерація й підтримка оптимальної вологості (55 – 70%).

Культура, яка виросла на нерухомому шарі при поверхневому культивуванні представляє корж із набряклих часток середовища, міцно зв'язаних зрослим міцелієм. Масу подрібнюють до гранул 5 мм. Культуру висушують до 10 – 12% вологості при температурах не вище 40°С, не більше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді – у шкіряній і спиртовій промисловості. У харчовій й особливо медичній промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

Схема очищення зводиться до наступного:

– видалення нерозчинних речовин;

– видалення супутніх розчинних речовин;

– фракціонування (хроматографічними методами).

Для виділення ферменту з поверхневої культури необхідна екстракція. Як правило, екстраген – вода. При цьому в розчин переходять цукри, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення й очищення завершує сушіння. Після сушіння препарат повинен містити не більше 6 – 8% вологи, тоді він може в герметичній тарі зберігатися до року без втрати активності.

Стандартизація ферментного препарату – доведення активності ферменту до стандартного, який відповідає вимогам держстандарту. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі – крохмаль, лактоза й ін.

З огляду на величезні перспективи застосування ферментних препаратів у різних галузях промисловості й сільського господарства, медицині, можна зробити висновок про необхідність розширення досліджень у цій області для оптимізації технології й гарантійного одержання високоактивних і стабільних препаратів мікробних ферментів.

Іммобілізація ферментів. Ферменти – речовини білкової природи й тому нестійкі при зберіганні, а також чутливі до теплових впливів. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів і продуктів реакції. Вирішити ці проблеми допомагає створення іммобілізованих ферментів. Початок цьому методу було покладено у 1916 році, коли Дж. Нельсон й Е.Гриффін адсорбували на вугіллі інвертазу й показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність. Сам термін "іммобілізовані ферменти узаконений в 1971 році, і означає будь-яке обмеження волі пересування білкових молекул у просторі.

Сутність іммобілізації ферментів – прикріплення їх в активній формі до нерозчинної основи або виведення на напівпроникну мембранну систему. Прикріплення ферменту до носія здійснюється адсорбційно, хімічним зв'язком або шляхом механічного включення ферменту в органічний або неорганічний гель (у капсулу й т.п.). При цьому допускається прикріплення ферменту тільки за рахунок функціональних груп, які не входять в активний центр ферменту й не беруть участі в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту або матриця може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин, порожніх волокон, трубочок, капсул і т.д. Має значення розмір часток носія. Важливо мати велику площу поверхні, тому рекомендуються невеликі частки діаметром 0,1 – 0,2 мм. Носієм ферменту може бути як природна речовина, так і синтетичний полімер.

Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:

1. Гетерогенний каталізатор легко відокремлюється від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використати фермент повторно, а також одержувати чистий від ферменту продукт.

2. Ферментативний процес із використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безупинно, регулюючи швидкість каталізуємої реакції й вихід продукту.

3. Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо відносно макромолекулярного субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу й інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.

4. Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло й звук. Іммобілізувати ферменти можна як шляхом зв'язування на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньо-молекулярної або міжмолекулярної зшивки білкових молекул низькомолекулярними біфункціональними сполуками, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.

Класифікація носіїв для ферментів. Для одержання іммобілізованих ферментів використовується обмежене число як органічних, так і неорганічних носіїв. Вони повинні володіти такими властивостями (Дж. Порат, 1974): висока хімічна й біологічна стійкість; висока хімічна міцність; достатня проникність для ферменту й субстратів, пористість, велика питома поверхня; можливість одержання у вигляді зручних у технологічному відношенні форм (гранул, мембран); легка активація; висока гідрофільність; невисока вартість.

Носії поділяють на дві групи: органічні, до складу яких входять низькомолекулярні й полімерні та неорганічні: макропористі та інші.

Слід зазначити, що органічні носії (як низько-, так і високомолекулярні) можуть бути природного або синтетичного походження. Природні полімерні органічні носії ділять відповідно до їхньої біохімічної класифікації на 3 групи: полісахаридні, білкові й ліпідні.

Синтетичні полімери також можна розділити на групи у зв'язку з хімічною будовою основного ланцюга макромолекул: поліметиленові, поліамідні, поліефірні.

Для іммобілізації ферментів найбільш широко використовуються природні полісахариди й синтетичні носії поліметильного типу, інші застосовуються значно рідше. Велике значення природних полімерів як носіїв для іммобілізації залежить від їх доступності й наявності реакційно-здатних функціональних груп, які легко вступають у хімічні реакції. Характерною рисою цієї групи носіїв також є їх висока гідрофільність. Недолік природних полімерів – нестійкість до впливу мікроорганізмів і досить висока вартість.

Найбільш часто для іммобілізації використовуються такі полісахариди, як целюлоза, декстран, агароза і їхні похідні. Целюлоза гідрофільна, має багато гідроксильних груп, що дозволяє модифікувати її, заміщаючи ці групи. Для збільшення механічної міцності целюлозу гранулюють шляхом часткового гідролізу, у результаті якого руйнуються аморфні ділянки. На їхнє місце для збереження пористості між кристалічними ділянками вводять хімічні зшивки. Гранульовану целюлозу досить легко перетворити в різні іонообмінні похідні, такі як ДЕАЕ-целлюлоза, КМЦ і т.д.

Широко поширені носії на основі декстрану, що випускаються під назвою "сефадекси". При висушуванні вони легко стискуються, у водному розчині сильно набухають. У цих носіях розмір пор у гелі регулюється ступенем зшивання. До групи декстранів відносять і крохмаль. Хімічно модифікований крохмаль зшивається агентами, такими як формальдегід. Таким способом був отриманий губчатий крохмаль, який володіє підвищеною стійкістю стосовно ферментів, гідролізу. Водорозчинні препарати на основі декстрану часто застосовуються як носії лікарських засобів у медицині.

Гарним носієм уважається агар. Його властивості поліпшуються після хімічної зшивки, наприклад, діепоксидними сполуками. Такий агар стає стійким до нагрівання, міцний, легко модифікується.

Білки як носії володіють рядом достоїнств: місткі, здатні до біодеградації, можуть застосовуватися в якості тонкої (товщиною 80 мкм) мембрани. Іммобілізацію ферментів на білкових носіях можна проводити як під час відсутності, так й у присутності зшиваючих агентів. Білки використовуються й у фундаментальних біологічних дослідженнях, і в медицині. До недоліків білків як носіїв відносять їх високу імуногенність (за винятком колагену й фібрину). Найбільше для іммобілізації використовуються структурні (кератин, фібрин, колаген), рухові (міозин) і транспортні (альбумін) білки.

Синтетичні полімерні носії застосовуються для ковалентної й сорбційної іммобілізації ферментів, для одержання гелів, мікрокапсул. Полімери на основі стиролу застосовуються при сорбційній іммобілізації. Вони можуть мати макропористу, ізопористу структуру, а також гетеропористу структуру. Для одержання полімерних гідрофільних носіїв широко використовується акриламід – похідне акрилової кислоти.

Широке поширення одержав метод включення ферментів і клітин у поліакриламідний гель, який має тверду просторову сітчасту структуру. Поліакриламідний гель стійкий до хімічних впливів. Дуже цікаву групу представляють поліамідні носії. Це групи різних гетероланцюгових полімерів з повторюваною амідною групою –С(ОН)–NH–. Наприклад, полімери на основі N–вінілпіролідону використовуються для одержання іммобілізованих ферментів, здатних повільно розпадатися в організмі. Крім того, вони біологічно інертні, що особливо важливо при використанні в медичних цілях. Істотним недоліком більшості полімерних носіїв є їхня здатність накопичуватися в організмі. Щодо цього перевага віддається природним полімерам, які гідролізуються ферментами. Тому до складу лікарських препаратів часто входить декстран, а із синтетичних носіїв – полімери на основі N–вінілпіролідону. У цей час ведуться експерименти по створенню синтетичних полімерів, які розщеплюються з утворенням нетоксичних продуктів обміну.

Методи іммобілізації ферментів. Існує два основних методи іммобілізації ферментів: фізичний і хімічний.

Фізична іммобілізація ферментів являє собою включення ферменту в таке середовище, у якому для нього доступною є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичній іммобілізації фермент не зв'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів:

– адсорбція на нерозчинних носіях;

– включення в пори гелю;

– просторове відділення ферменту від іншого обсягу реакційної системи за допомогою напівпроникної перегородки (мембрани);

– включення у двофазне середовище, де фермент розчинний і може перебувати тільки в одній з фаз.

Адсорбційна іммобілізація є найбільш старим з існуючих способів іммобілізації ферментів, початок їй було покладено ще у 1916 р. Цей спосіб досить простий і досягається при контакті водного розчину ферменту з носієм. Після відмивання неадсорбованого білка іммобілізований фермент готовий до використання. Утримання адсорбованої молекули ферменту на поверхні носія може забезпечуватися за рахунок неспецифічних ван-дер-ваальсових взаємодій, водневих зв'язків, електростатичних і гідрофобних взаємодій між носієм і поверхневими групами білка. Внесок кожного з типів зв'язування залежить від хімічної природи носія й функціональних груп на поверхні молекули ферменту. Взаємодії з носієм можуть виявитися настільки сильними, що сорбція біокаталізатору може супроводжуватися руйнуванням його структури. Наприклад, при адсорбції деяких рослинних клітин на гранулах цитодекса клітинна стінка деформується, повторюючи рельєф поверхні часток носія. Перевагою методу адсорбційної іммобілізації є доступність і дешевина сорбентів, що виступають у ролі носіїв. Їм також можна надати будь-яку конфігурацію й забезпечити необхідну пористість. Важливий фактор – простота застосовуваних методик. При адсорбційному зв'язуванні можна вирішити й проблему очищення ферменту, тому що зв'язування білка з носієм у багатьох випадках досить специфічне. На жаль, міцність зв'язування ферменту з носієм не завжди досить висока, що обмежує застосування методу. До недоліків адсорбційної іммобілізації варто віднести відсутність загальних рекомендацій, що дозволяють зробити правильний вибір носія й оптимальних умов іммобілізації конкретного ферменту.

Деяких з перерахованих ускладнень можна уникнути при іммобілізації ферментів шляхом включення в гель. Суть цього методу іммобілізації полягає в тому, що молекули ферменту включаються в тривимірну сітку з тісно переплетених полімерних ланцюгів, які утворюють гель. Середня відстань між сусідніми ланцюгами в гелі менше розміру молекули включеного ферменту, тому він не може покинути полімерну матрицю й вийти в навколишній розчин, тобто перебуває в іммобілізованому стані. Додатковий внесок у втримання ферменту в сітці гелю можуть вносити також іонні й водневі зв'язки між молекулою ферменту й навколишніми її полімерними ланцюгами. Простір між полімерними ланцюгами в гелі заповнено водою, на частку якої доводиться значна частина всього обсягу гелю. Наприклад, широко застосовувані гелі полімерів акрилової кислоти залежно від концентрації полімеру і його природи містять від 50 до 90% води.

Для іммобілізації ферментів у гелі існує два основних способи. При одному з них фермент поміщають у водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, у результаті чого утворюється полімерний гель із включеними в нього молекулами ферменту. У реакційну суміш часто додають також біфункціональні (містять у молекулі два подвійні зв'язки) зшиваючі агенти, які надають полімеру структуру тривимірної сітки. В іншому випадку фермент вносять у розчин готового полімеру, який тільки потім переводять у гелеподібний стан. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення в полімерний гель дозволяє створювати препарати будь-якої геометричної конфігурації, забезпечуючи при цьому рівномірний розподіл біокаталізатора в обсязі носія. Метод універсальний, застосовується для іммобілізації практично будь-яких ферментів, поліферментних систем, клітинних фрагментів і клітин. Фермент, включений у гель, стабільний, надійно захищений від інактивації внаслідок бактеріального зараження, тому що великі клітини бактерій не можуть проникнути в мілкопористу полімерну матрицю. У той же час, ця матриця може створювати значні перешкоди для дифузії субстрату до ферменту, знижуючи каталітичну ефективність іммобілізованого препарату, тому для високомолекулярних субстратів даний метод іммобілізації не застосовується взагалі.

Загальний принцип іммобілізації ферментів з використанням мембран полягає в тому, що водний розчин ферменту відокремлюється від водного розчину субстрату напівпроникною перегородкою. Напівпроникна мембрана легко пропускає невеликі молекули субстрату, але непереборна для великих молекул ферменту. Існуючі модифікації цього методу розрізняються лише способами одержання напівпроникної мембрани і її природою. Водний розчин ферменту можна включати усередину мікрокапсул, які представляють собою замкнуті сферичні пухирці з тонкою полімерною стінкою (мікрокапсулювання). При подвійному емульгуванні утворюється водна емульсія із крапель органічного розчину полімеру, який містить, у свою чергу, ще більш дрібні краплі водного розчину ферменту. Через якийсь час розчинник загускає, утворюючи сферичні полімерні частки з іммобілізованим у них ферментом. Якщо замість водонерозчинного полімеру використовуються рідкі вуглеводні з високою молекулярною масою, метод називається іммобілізацією шляхом включення в рідкі мембрани. До модифікацій методу іммобілізації ферментів з використанням напівпроникних оболонок відноситься також включення у волокна (при цьому замість крапель, що містять ферменти, використовують нитки) і включення в ліпосоми. Застосування систем мембранного типу дозволяє одержувати іммобілізовані препарати з високим вмістом ферменту. Метод, як і попередній, досить універсальний, тобто застосовується як до ферментів, так і до клітин, а також до їх фрагментів. Завдяки високому відношенню поверхні до обсягу й малої товщини мембрани вдається уникнути значних дифузійних обмежень швидкості ферментативних реакцій. Основний недолік мембранних систем – неможливість ферментативного перетворення високомолекулярних субстратів.

При іммобілізації ферментів з використання систем двофазного типу обмеження руху переміщення ферменту в обсязі системи досягається завдяки його здатності розчинятися тільки в одній з фаз. Субстрат і продукт ферментативного перетворення розподіляються між обома фазами відповідно до їх розчинності в цих фазах. Природа фаз підбирається таким чином, що продукт накопичується в тій з них, де фермент відсутній. Після завершення реакції цю фазу відокремлюють і екстрагують із неї продукт, а фазу, що містить фермент, знову використовують для проведення чергового процесу. Одним з найважливіших переваг систем двофазного типу є те, що вони дозволяють здійснювати ферментативні перетворення макромолекулярних субстратів, які неможливі при застосуванні твердих носіїв з обмеженим розміром пор.

Головною відмітною ознакою хімічних методів іммобілізації є те, що шляхом хімічної взаємодії на структуру ферменту в його молекулі створюються нові ковалентні зв'язки, зокрема між білком і носієм. Препарати іммобілізованих ферментів, отримані із застосуванням хімічних методів, володіють принаймні двома важливими достоїнствами. По-перше, ковалентний зв'язок ферменту з носієм забезпечує високу міцність кон’югату. При широкому варіюванні таких умов, як рН і температура, фермент не десорбується з носія й не забруднює цільових продуктів реакції. Це особливо важливо при реалізації процесів медичного й харчового призначення, а також для забезпечення стійких, відтворюваних результатів в аналітичних системах. По-друге, хімічна модифікація ферментів здатна призводити до істотних змін їхніх властивостей, таких як субстратна специфічність, каталітична активність і стабільність. Хімічна іммобілізація ферментів є мистецтвом, рівень якого визначається, у першу чергу, умінням експериментатора. Основне завдання експериментатора полягає у формуванні нових ковалентних зв'язків у молекулі ферменту при використанні його функціональних груп, несуттєвих для прояву його каталітичної активності. При хімічній модифікації ферменту його активний центр бажано захищати. При зіставленні різних прийомів іммобілізації хімічні методи для великомасштабних біотехнологічних процесів здаються малопривабливими через складність і дорожнечу. У промислових процесах, як правило, використовуються методи фізичної іммобілізації.

Застосування іммобілізованих ферментів. Особливо відчутний внесок іммобілізовані ферменти внесли в органічний синтез, в аналіз, у медицину, у процеси конверсії енергії, у харчову й фармацевтичну промисловості.

Для синтетичної органічної хімії важливо те, що у двофазних реакційних середовищах фермент зберігає каталітичну активність навіть при винятково малому вмісті води, тому рівновагу реакції (вихід продукту) експериментатор може регулювати в широких межах, підбираючи потрібний органічний розчинник. Іммобілізовані ферменти дали поштовх до створення принципово нових методів "безреагентного" безперервного аналізу багатокомпонентних систем органічних (у ряді випадків і неорганічних) сполук.

У наш час надзвичайно важливу роль за контролем навколишнього середовища й у клінічній діагностиці відіграють такі методи, як біолюмінесцентний аналіз й іммуноферментний аналіз.

У медицині іммобілізовані ферменти відкрили шлях до створення лікарських препаратів пролонгованої дії зі зниженою токсичністю й алергенністю. Іммобілізаційні підходи сприяють рішенню проблеми спрямованого транспорту ліків в організмі.

Проблеми біоконверсії маси й енергії в цей час намагаються вирішити мікробіологічним шляхом. Проте іммобілізовані ферменти вносять відчутний вклад у здійснення фотолізу води й у біоелектрокаталіз.

Заслуговує уваги й використання іммобілізованих ферментів у процесах переробки лігноцелюлозної сировини.

Іммобілізовані ферменти можуть використовуватися і як підсилювачі слабких сигналів. На активний центр іммобілізованого ферменту можна подіяти через носій, піддаючи останній ультразвуковій обробці, механічним навантаженням або фотохімічним перетворенням. Це дозволяє регулювати каталітичну активність системи фермент – носій під дією механічних, ультразвукових і світлових сигналів. На цій основі були створені механо- і звукочутливі датчики.

Промислові процеси із застосуванням іммобілізованих ферментів впроваджені насамперед у харчову й фармацевтичну промисловість. У харчовій промисловості за участю іммобілізованих ферментів здійснюють процеси одержання глюкозо-фруктових сиропів, глюкози, яблучної й аспарагінової кислоти, оптично активних L-амінокислот, дієтичного безлактозного молока, цукрів з молочної сироватки й ін.

У медицині іммобілізовані ферменти використовуються також як лікарські препарати, особливо в тих випадках, коли необхідний локальний вплив. Крім того, біокаталізатори широко використовуються в різних апаратах для перфузійного очищення різних біологічних рідин. Можливості й перспективи використання в медицині ферментів в іммобілізованому стані набагато ширші, ніж досягнуті на сьогоднішній день, саме на цьому шляху медицину чекає створення нових високоефективних методів лікування.

Іммобілізація клітин. У 70-х роках XX століття з'явилися перші публікації про іммобілізацію клітин мікроорганізмів, а перше промислове застосування іммобілізованих клітин було здійснено в Японії в 1974 р. З їхньою допомогою одержували аспарагінову кислоту.

Іммобілізовані клітини мають ряд переваг як перед іммобілізованими ферментами, так і перед вільними клітинами:

– відсутність витрат на виділення й очищення ферментів;

– зниження витрат на виділення й очищення продуктів реакції;

– більш висока активність і стабільність;

– можливість створення безперервних і напівбезперервних автоматизованих процесів;

– здатність до тривалого функціонування поліферментних систем без екзогенних кофакторів.

Для іммобілізації можуть бути використані клітини в різному стані: живі й ушкоджені в різному ступені. Одностадійні реакції можуть здійснювати й живі, і ушкоджені клітини. Поліферментні реакції проводять із застосуванням живих клітин, які можуть тривалий час регенерувати АТФ і коферменти (НАДФ, НАД).

Проблема використання ферментативної активності іммобілізованих мікроорганізмів має глибоке коріння. Більше 150 років тому швидкий спосіб одержання оцту був заснований на застосуванні мікроорганізмів, адсорбованих на деревній стружці. Методи іммобілізації клітин схожі з методами іммобілізації ферментів.

Хімічний метод заснований на утворенні ковалентних зв'язків з активованим носієм, на поперечній зшивці клітин за рахунок активних груп у клітинній оболонці з біфункціональними реагентами (наприклад, глутаровим альдегідом).

До фізичних методів відносяться адсорбція й агрегація.

Іммобілізація клітин шляхом включення в різні гелі, мембрани, волокна заснована на хімічних і фізичних взаємодіях. Хімічні методи використовуються рідше в порівнянні з іншими методами й малопридатні для іммобілізації живих клітин. Найбільшого поширення одержало включення клітин до складу гелів, мембран і волокон. При такому способі іммобілізації клітини можуть зберігати життєздатність й у присутності поживного середовища розмножуватися в приповерхневих шарах гелю. Біокаталітична активність цілих іммобілізованих клітин у цей час може бути використана в різних галузях науки й техніки:

– при біосинтезі й трансформації таких сполук, як амінокислоти, органічні кислоти, антибіотики, стероїди, вуглеводи, вуглеводні, нуклеотиди й нуклеозиди;

– у пивоварстві й виноробстві;

– при очищенні стічних і природних вод;

– при екстрагуванні металів зі стічних вод;

– при асиміляції сонячної енергії;

– при виготовленні водневих сонячних елементів;

– в азотфіксації;

– в аналітичних цілях при виготовленні електродів.

Найбільша кількість досліджень по іммобілізації клітин мікроорганізмів проведена японськими дослідниками. Особливі успіхи були досягнуті ними в області синтезу амінокислот, органічних кислот й антибіотиків. У Московському державному університеті був розроблений метод одержання аспарагінової кислоти, який за ефективністю не уступає японським. Клітини E.coli, включені в армований поліакриламідний гель, були з успіхом використані для одержання аспарагінової кислоти, період напівжиття каталізатора – 110 діб. Іммобілізувати можна не тільки клітини мікроорганізмів, але й клітини рослинних і тваринних тканин, використовуючи їх для синтезу фізіологічно активних сполук.

Цікаві можливості відкриваються й при іммобілізації клітинних органел як активних поліферментних систем. Все це свідчить про перспективність розвитку одного з напрямків біотехнології, пов'язаного з вивченням і застосуванням іммобілізованих клітин.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: