Главная | Случайная
Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Фазово-контрастная микроскопия




 

Фазово-контрастная микроскопия позволяет получать контрастные изо­бражения неокрашенных, неконтрастных объектов, в которых темные и светлые места соответствуют различ­ной толщине и оптической плотности препарата.

Известно, что контрастность изображения находится в прямой зависимости от степени поглощения света различными структурными элементами объекта. Если в объекте чередуются места, сильно и слабо адсорби­рующие свет, то последний, проходя через объект, из­меняет свою амплитуду. Интенсивность световых лучей, прошедших через различные участки такого объекта, будет различной. Такие препараты называются ампли­тудными. Наряду с амплитудными существуют совершенно прозрачные объекты. Пройдя через такие объекты, свет или совсем не ослабляется, или ослабляется чрезвы­чайно мало. Однако в зависимости от различных пока­зателей преломления отдельными участками объекта или его неравномерной толщины по выходе из объекта смещается фаза светового колебания. Сдвиг фазы про­исходит из-за неодинаковой скорости распространения света в средах с различной оптической плотностью. В местах большей оптической плотности свет как бы замедляет свою скорость, изменяется по фазе. Такие объекты называются фазовыми. К ним относится большинство живых клеток и микроорганизмов. Глаз человека и фотопластинка фазовые колебания света не выявляют. Для их обнаружения служит метод фазовых контрас­тов, предложенный в 1934 г. голландцем Цернике.

Метод фазовых конт­растов основан на ис­пользовании теории Аббе о дифракционном по­строении изображения в микроскопе/

Сущность метода сво­дится к тому, что обыч­ный конденсор микроско­па заменяют на специальный конденсор с коль­цевой диафрагмой, а в револьвер ввинчивают специальный объектив. На полевую линзу этого объектива нанесена фазовая пластинка в виде кольца, состоящая из тонкого слоя специ­ального состава. Кольцо света, проходя через кольцевую диафрагму конденсора и объект, фокусируется на фазовой пластинке объ­ектива. Фазовая пластинка значительно ослабляет силу света нулевого максимума и смещает фазы проходящих через него прямых световых волн на 90°.

Луч света, падающий на прозрачный объект, рас­щепляется на два луча — прямой и дифрагированный. Прямой луч (рис. , А) идет из кольцевой диафрагмы, проходит через частицу объекта и фокусируется на кольце фазовой пластинки. Дифрагированный луч, (рис. , Б), проходя через объект, не попадает на фа­зовую пластинку. Оптические пути этих двух лучей оказываются различными. Между ними создается раз­ность фаз, и невооруженным глазом нельзя уловить это смещение фаз. Однако фазовой пластинкой эти фазо­вые изменения преобразуются в амплитудные, воспри­нимаемые глазом изменения. Прозрачные в светлом поле зрения препараты становятся резко контрастными на светлом фоне (положительный фазовый контраст) или блестящими на темном фоне (отрицательный фа­зовый контраст).

Рис.16. Ход лучей в фазово-контрастном микроскопе: А — прямой и В — дифрагирован­ный лучи  

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопеи состоит из: 1) набора объективов-ахроматов. В каждом объективе имеется фазовая пластинка в виде темного кольца, нанесенного на внутреннюю линзу. Назначение пластинки состоит в изменении фазы нулевого максимума на 90° и уменьшении его интенсивности; 2) фазово-контрастного конденсора и револьвера с набором кольцевых диафрагм, которые ус­танавливают применительно к каждому объективу. Для наблюдения обычным способом в конденсоре имеется ирис-диафрагма, а в диске револьвера — отверстие для пропуска световых лучей. Смена кольцевых диафрагм перед объективом производится поворотом револьвера до фиксации. Для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазовой пластинки объектива служат два боковых винта; 3) вспомогательного микроскопа, встав­ляемого в тубус вместо окуляра и служащего для наблюдения при центрировке кольцевой диафрагмы по отношению к фазовой пластинке.

 

 

 

 

 

 

Настройку микроскопа с фазово-контрастной при­ставкой производят следующим образом:

1. Заменяют объективы и обычный конденсор в мик­роскопе на фазовые.

2. 2. Поворотом диска конденсора устанавливают ну­левую диафрагму (в окошечке должна появиться цифра 0).

3. Помещают препарат на столик микроскопа, при объективе ХЮ уста­навливают освещение и производят фокусировку. Диафрагму конденсора открывают полностью.

4. Заменяют нулевую диафрагму конденсора на диафрагму, соответствую­щую увеличению используемо­го фазового объектива. Так, при рассматривании пре­парата с объективом ХЮ повернуть ре­вольвер конденсора до появления в окошечке цифры 10.

5. Заменяют окуляр микроскопа на вспомогательный микроскоп. Ослабив винт, осторожно поднимают выдвижную трубу вспомога­тельного микроскопа до по­явления отчетливого изображения коль­цевой диафрагмы конденсора и фазовой пластинки объектива.

6. Фиксируют выдвижную трубу вспомогательного микроскопа вин­том.

7. Вращением центрировочных винтов конденсора совмещают коль­цевую диафрагму конденсора с фазовым кольцом объектива.

8. Вынимают вспомогательный микроскоп из тубу­са, вставляют нуж­ный окуляр, устанавливают фокус и изучают объект.

При каждой смене объективов необходимо повторить все операции, указанные в пунктах 4, 5, 6, 7, 8.

Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности оптической системы микро­скопа. Однако она позволяет видеть тонкие детали структуры живых микробов, изучить стадии их развития и процесс деления, выявить влияние химических ве­ществ, антибиотиков и других факторов на микробную клетку, измерить ее прижизненную величину. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

ДИК (дифференциально-интерференционный контраст) - является прекрасным механизмом для создания контраста в прозрачных препаратах. Микроскопия с ДИК представляет собой интерференционную систему с расщеплением пучка света, при которой контрольный пучок отклоняется на небольшое расстояние, обычно меньшее, чем диаметр дифракционного кружка. С помощью данного метода получается монохроматическое оттененное изображение, которое отображает градиент оптических путей как высоко-, так и низкопространственных частот, присутствующих в препарате. Те участки препарата, при прохождении через которые оптические пути удлиняются по отношению к контрольному пучку, выглядят ярче или темнее, тогда как участки, между которыми различия меньше, обладают противоположным контрастом. Чем круче становится градиент оптических пучков, тем резче контраст изображения.

Хоффмановский контраст (ХК) представляет собой метод косого освещения, повышающий контраст в окрашенных и неокрашенных препаратах за счет образования градиента оптических фаз. ХК пoзвoляeт нaблюдaть тpexмepнoe изoбpaжeниe живыx oбpaзцoв в плacтикoвыx чaшкax c выcoкoй чeткocтью. За счет использования бoльшиих paбoчих paccтoяний и выcoких чиcлoвых aпepтуp метод позволяет тoчнo oтcлeживaть движeние в пoлe зpeния, нaпpимep, пpи проведении микроманипуляций.

ХК мoжeт быть пpимeнeн нa микpocкoпe c флуopecцeнтным ocвeтитeлeм. Изучeниe мopфoлoгии c пpимeнeниeм флуopecцeнции или бeз тaкoвoй вoзмoжнo бeз cмeны oбъeктивoв и oбpaзцa. Стоит отметить преимущество Хоффмановского контраста по сравнению с Фазовым контрастом. Известно, что Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo - появление светящегося ореола по контуру изображения объекта. B peзультaтe Bы мoжeтe пoтepять вaжную инфopмaцию. XК нe дaeт Гaлo, чтo пoзвoляeт лeгкo oпpeдeлять cвoйcтвa кpaeвыx cтpуктуp, нaпpимep, тoчнo зaмepять углы или расстояния.


 




Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2019 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных