Якісні реакції на ліпіди

Мета роботи: Вивчити властивості жирів і жироподібних речовин. Засвоїти метод визначення концентрації холестеролу в сироватці крові.

Питання для самопідготовки:

1. Визначення ліпідів.

2. Класифікація ліпідів.

3. Триацилгліцероли і їх властивості.

4. Насичені і ненасичені жирні кислоти.

5. Фосфоліпіди і гліколіпіди, їх функції.

6. Стерини і їх функції. Холестерол.

ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА

Ліпіди – це гетерогенна група сполук, безпосередньо або опосередковано пов'язаних з жирними кислотами. їх загальною властивістю є 1) відносна нерозчинність у воді та 2) розчинність в неполярних розчинниках - ефірі, хлороформі, бензолі. До ліпідів відносяться жири, масла, воски та спорідненні сполуки.

Ліпіди є важлива складова частина харчових продуктів. В ліпідах містяться жиророзчинні вітаміни і "незамінні" жирні кислоти. Жир служить в організмі досить ефективним джерелом енергії. Він забезпечує теплоізоляцію, накопичуючись у підшкіряному шарі та біля певних органів. Досить великий вміст жиру у нервовій тканині. Можна виділити такі важливі функції ліпідів: енергетична, водозапасна, структурна, захисна, терморегулююча, надає деяким тваринам плавучість, вони є розчинники для жиророзчинних вітамінів: A, D, Е, К.

Класифікація ліпідів (за Блором). 1. Прості ліпіди – складні ефіри вищих жирних кислот з різними спиртами. а) жири – складні ефіри вищих жирних кислот з трьохатомним спиртом гліцеролом. До них відносяться тваринні жири, які за консистенцією тверді (виняток риб'ячий жир, він рідкий). Рослинні жири – це рідини. Їх ще називають маслами – соняшникове, оливкове, облепіхове (виняток – кокосове масло, воно тверде). Загальна будова жиру:

Під впливом кислот, лугів, ферментів (ліпаз) - жири підлягають гідролізу, з утворенням гліцеролу та вищих жирних кислот:

Продуктами лужного гідролізу жирів є солі вищих жирних кислот – мила, тому цей процес має назву омилення. Солі лужних металів розчинні у воді. Солі лужноземельних та важких металів – нерозчинні у воді.

Жирні кислоти, які входять до складу жирів, містять парну кількість атомів вуглецю. Найбільш часто зустрічаються у складі жирів – пальмітинова (C₁₅H₃₁COOH) та стеаринова (C₁₇H₃₅COOH) жирні кислоти. Їх ще називають насиченими жирними кислотами, бо вони не мають подвійних зв'язків у структурі. Іноді в жирних кислотах є один чи декілька подвійних зв'язків (- С = С -). Такі жирні кислоти називають ненасиченими (олеїнова, лінолева, ліноленова).

Від довжини вуглецевих ціпків жирних кислот, які входять до складу жиру, та від вмісту в ньому ненасичених жирних кислот залежить його крапка топлення. Рослинні масла рідкі тому, що в них багато ненасичених жирних кислот.

б) воски – складні ефіри вищої жирної кислоти з вищими одноатомними спиртами. Приклади: бджолиний віск, віск на поверхні овочів та фруктів, у складі зовнішнього скелету комах (хітин).

2. Складні ліпіди – складні ефіри вищих жирних кислот зі спиртами, які додатково мають і інші групи.

а) фосфоліпіди – мають крім жирних кислот та спирту залишок фосфорної кислоти. Часто в їх склад входять азотисті основи. Фосфоліпіди є компоненти мембран клітин. їх багато у серці, печінці, та у нервовій тканині людини та тварин, у насіннях рослин, яйцях птахів.

б) гліколіпіди– мають жирні кислоти, спирт сфінгозин та вуглеводний компонент. Вони являються компонентами мембран клітин, особливо їх багато в мієліновій оболонці нервових волокон, а також вони являються компонентами мембран хлоропластів. їх багато в тканинах мозку, в клітинах крові.

в) інші складні ліпіди – сильфоліпіди, аміноліпіди, ліпопротеїни.

3. Попередники та похідні ліпідів. Важливіші – стерини та стериди.

Стерини – високомолекулярні циклічні спирти, які мають у своєму складі ядро циклопентанпергідрофенантрену:

Відрізняються один від одного будовою бокового вуглеводневого ланцюгу та наявністю подвійних зв'язків. Найбільш розповсюджений холестерол.

Це кристалічна речовина з жирним блиском. Міститься у всіх клітинах. Особливо її багато у нервовій тканині, в плазматичних мембранах, плазмі, жовчі.

Ліпіди надходять в організм людини з їжею і піддаються в шлунково-кишковому тракті перетравленню й усмоктуванню.

Розщеплення ліпідів здійснюється у 12-палій кишці, куди надходить ліпаза із соком підшлункової залози та жовчні кислоти у складі жовчі. Емульгування жиру – обов'язкова умова для травлення, тому як робить ліпіди більш доступними для дії ліпаз. Емульгування здійснюється за участю жовчних кислот, які оточують краплю жиру та знижують поверхневе натягнення, що призводить до подрібнення краплі.

Жир гідролізується панкреатичною ліпазою спочатку до диацилгліцерину, а потім до моноацилгліцерину. Всмоктування здійснюється за участю жовчних кислот, які утворюють разом з моноацилгліцеринами, холестеролом і жирними кислотами змішані міцели – розчинні комплекси, що забезпечують перехід продуктів гідролізу в клітини слизової кишечника. Жовчні кислоти з током крові доставляються у печінку, потім знову секретуються жовчю в кишечник, таким чином повторно використовуються. Але протягом доби приблизно 0,3 г жовчних кислот не всмоктується, а виводиться з організму. Жовчні кислоти синтезуються в печінці із холестеролу.

Синтез ліпідів із продуктів, що всмокталися, їх розщеплення відбувається в кишковій стінці. Далі вони попадають звідси в кров і лімфу і транспортуються в тканині й органи. Транспорт ресинтезованого жиру через лімфатичну систему і кровообіг можливий тільки після включення його в склад ліпопротеїнів.

Проміжний обмін ліпідів полягає в синтезі і депонуванні їх у жировій тканині, мобілізації для використання в якості джерела енергії і, нарешті, у їх окисних перетвореннях. Багато ліпідів (особливо фосфоліпіди) використовуються організмом як пластичний матеріал, входячи в структуру різних клітинних мембран (цитомембрани, мембрани мітохондрій, мембрани цитоплазматичної сітки та ін.).

Розщеплення ліпідів у шлунково-кишковому тракті, в органах і тканинах здійснюється різними ліпазами. Про активність останніх можна судити по утворенню вільних жирних кислот у процесі інкубації тканинних екстрактів або травневих соків із тим або іншим жиром при оптимальних температурі і розмірі рН.

Жирні кислоти в тканинах схильні до бета-окислення (особливо інтенсивно в печінці). Кінцевим продуктом цього окислення є ацетил-коэнзим А, ацетильный залишок якого окислюється далі в циклі трикарбонових кислот до СО₂ і Н₂О. Однак бета-окислення може відбуватися не до кінця, а до утворення зв'язаних із коэнзимом А ацетилів чотиривуглецевих кислот (бета-оксибутирил-коензим А та ацетоацетил-коензим А). При гідролізі цих сполук утворюються кетонові тіла – бета-оксимасляна та ацетоуксусні кислоти, що є одними з важливих транспортних форм продуктів обміну ліпідів. Вони легко проникають із крові в тканині та органи (зокрема, у м'язи), де піддаються подальшому окисленню. Кетонові тіла можуть синтезуватися і з ацетил-коензиму А.

Вільні жирні кислоти і кетонові тіла служать одним із найголовніших джерел енергії при тривалій м'язовій діяльності й у періоді відпочинку після фізичних навантажень.

При надмірному утворенні кетонових тіл в організмі вміст їх у крові різко підвищується (гіперкетонемія), і вони в значних кількостях з'являються в сечі (кетонурія). Якщо при цьому із сечею виділяється багато ацетону, така кетонурія розглядається як патологічна, що свідчить про серйозні порушення окислення жирних кислот і їх продуктів.

ПРАКТИЧНА ЧАСТИНА

Практичне значення роботи: за допомогою якісних реакцій визначають у біологічних рідинах продукти розщеплення ліпідів, за якими можна судити про ліпідний обмін. За визначенням концентрації холестеролу в сироватці крові судять про ліпідний обмін. При порушенні ліпідного обміну холестерол може накопичуватися в крові. Збільшення вмісту холестеролу спостерігається при атеросклерозі, цукровому діабеті, вроджених порушеннях обміну, захворюваннях печінки.

Матеріали і реактиви: рослинна олія, 50%-вий спиртовий розчин КОН, концентрована НС1, 5%-вий розчин ВаС1₂, 5%-вий розчин (СН₃СОО)₂Рb, кристалики KHSО₄, гліцерол, хлороформний розчин холестеролу, концентрована H₂SO₄, колба ємністю 50 мл, піпетки, спиртівка. Сироватка крові, стандартний розчин холестеролу (180 мг холестеролу розчиняють у 100 мл етилового спирту), реактив А – суміш крижаної оцтової кислоти (30 мл), оцтового ангідриду (150 мл) і концентрованої сірчаної кислоти (30 мл) (1:5:1). Готувати реактив необхідно при постійному охолодженні. Сірчану кислоту додають в останню чергу, дуже повільно, постійно помішуючи. Реактив зберігають у холодильнику в посуді з темного скла з притертою пробкою.

Устаткування: Штатив із пробірками, піпетки, мікропіпетки, циліндри, колба, термостат (37° С), ФЕК, міліметровий папір.

Принцип методу:

1. Омилення жиру. Жири під впливом лугів гідролізуються з утворенням мила і гліцерола.

2. Одержання вільних жирних кислот. При додаванні до мила концентрованої соляної кислоти утворюються вільні жирні кислоти.

3. Якісна реакція на гліцерол (акролеїнова реакція). При нагріванні гліцеролу з гідросульфатом калію відбувається дегідратація, у результаті якої гліцерин перетворюється в акролеїн-ненасичений альдегід етилового ряду зі специфічним запахом.

4. Одержання нерозчинних мил. При додаванні до розчину калієвого мила розчину солей барію і свинцю утворюються нерозчинні солі жирних кислот.

5. Якісна реакція на холестерол (реакція Сальковського). Реакції якісного виявлення холестеролу засновані на його спроможності перетворюватися з вторинного спирту в ненасичений вуглеводень.

6. Визначення концентрації холестеролу у сироватці крові. Холестерол при наявності оцтового ангідриду і суміші оцтової і сірчаної кислот дає зелене забарвлення, інтенсивність якого визначають на ФЕКі.

Хід роботи:

1. Омилення жирів. У колбу з 1 мл рослинної олії додають 20 мл спиртового розчину КОН, суміш перемішують і кип'ятять. Щоб перевірити відбувся гідроліз чи ні, відбирають у пробірку декілька крапель даного розчину і додають 1 мл дистильованої води. При наявності жирових крапель гідроліз продовжують далі. Після омилення, розчин розводять до об'єму 20 мл дистильованою водою, і таким чином одержують розчин калієвого мила, з якого виконують досліди 2-4 для визначення наявності в ньому гліцеролу, жирних кислот і одержання нерозчинних мил.

2. Одержання вільних жирних кислот. У пробірку з 2 мл розчину калієвого мила додають 0,5 мл концентрованої НС1. Жирні кислоти, що утворюються, нерозчинні у воді тому будуть збиратися на її поверхні.

3. Якісна реакція на гліцерол (акролеїнова реакція). На дно двох пробірок кладуть декілька кристаликів KHSО₄, потім в одну пробірку вносять 5 крапель розчину, отриманого в досліді 1, а в другу – 5 крапель гліцеролу, нагрівають у полум'ї пальника. Утворення акролеїну визначають за характерним запахом альдегіду – запах горілого сала.

4. Одержання нерозчинних мил. У 2 пробірки з 2 мл розчину калієвого мила вносять відповідно по 1 мл розчину ВаСl і (СН₃СОО)₂Рb. Спостерігають утворення нерозчинних барієвого і свинцевого мил.

5. Якісна реакція на холестерол (реакція Сальковського). У суху пробірку вносять 0,5 мл розчину холестеролу в хлороформі, додають 0,5 мл концентрованої H₂SO₄ і обережно струшують. Після розшарування фаз спостерігають за зміною фарбування: верхній прошарок, що містить холестерол у хлороформі, забарвлюється в пурпурно-червоний колір, а нижній (прошарок сірчаної кислоти) – у темно-червоний колір із зеленою флуоресценцією. Фарбування згодом переходить у фіолетове, потім зелене і, нарешті, у жовте.

Результати дослідів вносять у таблицю:

Таблиця 2

Результати якісних реакцій на ліпіди

6. Визначення концентрації холестеролу у сироватці крові. У пробірку вносять 0,1 мл сироватки крові, додають швидко 2,1 мл реактиву А, негайно перемішують, 10 разів струшують і поміщають у термостат (37° С). Через 20 хвилин суміш у пробірці набуває зеленого кольору. Для визначення молярної концентрації холестеролу в досліджуваній пробі за оптичною щільністю необхідно побудувати калібрований графік. Знайдену концентрацію холестеролу множать на 1000 (кількість сироватки – 0,1 мл). Коефіцієнт перерахунку в одиниці СІ (ммоль/л) дорівнює – 0 0258.

Для побудови калібрувального графіка слід зі стандартного розчину холестеролу (у 1 мл утримується 1,8 мл холестеролу) взяти по 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 мл і додати реактив А до обсягу 2,2 мл у кожній пробірці. При цьому в пробах буде утримуватися така кількість холестеролу: 0,09, 0,18, 0,27, 0,36, 0,45 мг відповідно. Після додавання реактиву А пробірки енергійно струшують і поміщають у термостат при t 37° С. Через 20 хвилин фотоколориметру-ють. Будують графік, де по осі ординат – екстинкція, а по осі абсцис – відомі концентрації холестеролу.

Вміст загального холестеролу в сироватці крові людини знаходиться в межах 2,97 – 8,79 ммоль/л.

Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Біологічне значення холестеролу.

2. Принцип методу визначення холестеролу в крові.

3. Умови, необхідні для перетравлення жиру. Перетравлення в шлунково-кишковому тракті.

4. Роль жовчі в перетравленні жирів.

5. Усмоктування і транспорт ліпідів.

6. β-Окислення жирних кислот.

7. Окислення гліцерину.

8. Синтез жирних кислот.

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ № 4

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: