Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови

Сущность метода. Определение белков основано на их способности поглощать ультрафиолетовые лучи определенной длины волны. Большинство белков имеет максимум поглощения при длине волны 280 нм.

Оборудование. 1. Пробирки. 2. Пипетки на 1 и 5 мл. 3. Спектрофотометр.

Ход работы. Сыворотку крови разводят физиологическим раствором в 250 раз (0,1 мл сыворотки доводят до 25 мл). Наливают этот раствор в кювету спектрофотометра и измеряют оптическую плотность при 280 нм против физиологического раствора.

Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор белка: 100 мг кристаллического альбумина растворяют в 100 мл физиологического раствора. В 1 мг такого раствора содержится 1 мг (1000 мкг) белка.

В пробирки наливают по 0,5; 1; 1,5; 2,5 мл стандартного раствора белка и объем доводят физиологическим раствором до 5 мл. Содержание белка в 1 мл в этих пробирках равняется 100, 200, 300, 400, 500 мкг. Затем определяют оптическую плотность растворов белка в этих пробирках на спектрофотометре.

При построении калибровочного графика на оси абсцисс концентрацию белка мкг/мл, а на оси ординат – найденную величину оптической плотности. Исходя из графика, можно вычислить процентный коэффициент экстинкции, поделив оптическую плотность на соответствующую концентрацию. Он дает возможность вычислить содержание белка в пробе, не обращаясь, каждый раз к графику.

Обработка результатов. Количество белка в сыворотке выражают в грамм-процентах (г%) и рассчитывают по формуле:

где С – концентрация белка в пробе в мкг/мл (по графику); В – разведение сыворотки (250).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: