Производственная рефрактометрия

Измерение показателя преломления служит одним из универсальных методов детектирования в жидкостной хроматографии (раздел 5.3). Этот измерительный принцип можно легко перенести в условия производства. В промышленности часто используют дифференциальные рефрактометры Эббингхауса, включающие две полые призмы. Через одну из них непрерывно протекает производственный раствор, вторая заполнена раствором сравнения при таком способе измерения возникают помехи в случае анализа мутных, окрашенных, а также содержащих пузырьки газа или взвешенные частицы растворов. Эти трудности можно частично преодолеть, если для анализа непрозрачных растворов вместо видимого света использовать излучение в ближней ИК-области.

Рис. 7.31. Устройство промышленного зонда-рефрактометра.

В последнее время разработана более устойчивая к помехам конструкция рефрактометра (рис. 7.31). В ней используют призму, для которой угол между торцевой и боковой плоскостями равен критическому. Такой рефрактометр можно выполнить в виде зонда-датчика и непосредственно вводить его в технологический раствор.

Промышленные рефрактометры часто используют на химических и фармацевтических производствах. Они позволяют регистрировать изменения показателя преломления до 10~⁴ единиц и очень удобны для контроля процессов ректификации и множества других, включая определение содержания экстракта в пивном сусле.

Инфракрасные анализаторы

Простейшие без дисперсионные ИК-анализаторы применяются главным образом для анализа газов. Как следует из названия, здесь используют полихроматический поток излучения. Приемниками излучения служат главным образом пневматические детекторы. Принципиальная схема ИК-анализатора этого типа приведена на рис. 7.32.

Рис. 7.32. Устройство бездисперсионного инфракрасного газоанализатора.

Две идентичные газовые кюветы — измерительную и кювету сравнения — облучают пульсирующими потоками ИК-излучения равной интенсивности. Пульсацию потоков осуществляют при помощи механического прерывателя с вращающимися лопастями. Кювету сравнения заполняют газом, не поглощающим в ИК-области, -обычно азотом. Пневматический детектор состоит из двух камер, разделенных мембраной. Мембрана одновременно является одним из электродов конденсатора. Камеры заполняют чистым определяемым газом, например, СО. Пульсирующее излучение поглощается газом, находящимся в камерах. Это приводит к увеличению температуры и, соответственно, периодическим колебаниям мембраны. Если интенсивности световых потоков, падающих на обе камеры, не одинаковы, мембрана смещается относительно нейтрального положения. Это приводит к изменению емкости конденсатора, пропорциональному величине поглощения.

Поскольку используется полихроматическое ИК-излучение, возможны помехи со стороны других газов, поглощающих в ИК-области. Однако, если природа мешающего компонента известна, помехи удается устранить. Для этого на пути каждого светового потока между кюветой и детектором ставят по одной дополнительной кювете, заполненной мешающим компонентом. Они играют роль светофильтров, отсекая излучение тех длин волн, при которых поглощает мешающий компонент. Если этот способ не помогает, необходима хотя бы частичная монохроматизация исходного излучения.

Примеры применения бездисперсионных ИК-анализаторов приведены в табл. 7.11. В зависимости от диапазона определяемых концентраций длина оптического пути газовых кювет может составлять от 0, 75 до 20 м.

Таблица 7.11. Применение без дисперсионных ИК-анализаторов для определения газов.

Дисперсионные ИК-анализаторы необходимо применять в тех случаях, когда селективность бездисперсионяых анализаторов (в том числе с применением светофильтров) оказывается недостаточной, при анализе жидких сред, а также при измерениях в области менее 1000 смГ¹. Обычно измерения с использованием дисперсионных ИК-анализаторов проводят при двух длинах волн, используя одну длину волны непосредственно для измерения, а вторую — для компенсации погрешностей вследствие колебаний параметров прибора.

В последнее время все более широкое применение в производственном анализе находят ИК-спектрометры с фурье-преобразованием. Они позволяют непрерывно анализировать в реальном времени газы, жидкости и твердые тела. С их помощью можно не только определять состав и содержание вещества, но и контролировать степень полимеризации, толщину пленок и покрытий, обнаруживать примеси.

Для производственного контроля состава твердых тел все шире используют ИК-спектроскопию в ближней области. Как правило, измерения производят в отраженном свете (рис. 3.86). При помощи ИК-спектроскопии в ближней области можно определять не только обобщенные параметры такие, как октановое число (см. выше), но и отдельные компоненты. Этим методом можно определять влажность и содержание белка в зерне, оценивать параметры качества полупродуктов в фармацевтической или молочного порошка — в пищевой промышленности.

Кислородные анализаторы

Определение содержания кислорода имеет большое значение для контроля процессов горения, состава отходящих газов, в металлургии. Важно также уметь определять содержание растворенного кислорода в различных жидкостях. В промышленности кислород определяют как физическими (измерение магнитной восприимчивости, теплопроводности), так и химическими методами — при помощи потенциометрии, амперометрии и калориметрии (с использованием процессов каталитического окисления).

Ряд уже упоминавшихся методов определения кислорода применяют и на производстве. К ним относятся методы с использованием твердых электролитов (кондуктометрические и потенциометрические) и амперометрическое определение кислорода в растворах при помощи датчика Кларка. Специфика кислородных датчиков, применяемых в промышленности, касается главным образом лишь конструктивных особенностей, которые изменяются от производителя к производителю.

Производственная хроматография

Процессы производственной хроматографии отличаются от лабораторных с точки зрения одной важной детали: анализируемую пробу необходимо отобрать непосредственно из производственного потока — как правило, при высокой температуре. Для отбора проб используют высокоточные дозирующие вентили. Ввод пробы непосредственно в хроматограф осуществляют, как обычно, при помощи шприца через прокладку (рис. 5.2). При анализе жидкостей часто бывает необходим предварительный сброс паров. Хроматографическая аппаратура, используемая на производстве, должна быть простой и надежной в эксплуатации. Обычно применяют лишь достаточно ограниченный круг неподвижных фаз. Сложные варианты хроматографических разделений — градиентные, с использованием дериватизации — как правило, не применяют. Время хроматографического разделения должно быть как можно меньше. Очень часто ограничиваются неполным разделением пиков на колонке, предпочитая разделять их при помощи математических методов. Часто анализ одной и той же пробы проводят параллельно на нескольких колонках с неподвижными фазами разной селективности.

Для увеличения селективности используют и отделение мешающих компонентов при помощи предколонки, играющей роль фильтра. Схема промышленного хроматографа с предколонкой изображена на рис. 7.33. Поскольку задача предколонки состоит в как можно более полном отделении компонентов матрицы, ее необходимо периодически регенерировать. Для этого время от времени через предколонку пускают поток газа-носителя в обратном направлении для десорбции накопившихся веществ.

Рис. 7.33. Схема промышленного хроматографа с предколонкой.

В производственную практику постепенно начинает внедряться и высокоэффективная жидкостная хроматография. Хотя в случае ВЭЖХ при переходе от лабораторных к производственным условиям возникает гораздо больше проблем, чем в случае газовой хроматографии, во многих сферах, например, в пищевой или фармацевтической промышленности, метод ВЭЖХ оказывается поистине незаменим. В сочетании с методом ультрафильтрации для удаления высокомолекулярных компонентов ВЭЖХ находит все возрастающее применение и в области биотехнологии.

7.4. Литература

H.Bartels, Techniken der Automatisierung chemischer Analysenverfah-ren, in Analytiker-Taschenbuch, Bd. 2, S. 47/63, Akademie-Verlag, Berlin, 1981.

J.Ruzicka, E.H.Hansen, Flow Injection Analysis, 2 ed., Wiley, New York, 1988.

K.Doerffel, H.Miiller, M.Uhlmann, Prozefianalytik, Deutscher Verlag fur Grundstoffindustrie, Leipzig, 1986.

R.Niefiner, Chemische Sensoren: Prinzipien und Anwendungen, in Analytiker-Taschenbuch, Bd.7, S.55, Akademie-Verlag, Berlin, 1987.

ИММУННЫЙ АНАЛИЗ

Цели изучения

• Изучить равновесия антитело-антиген и их использование в анализе.

• Понять различные варианты иммунного анализа.

• Ознакомиться с тем, как можно проводить иммунный анализ с использованием меток.

Введение

D Антитело представляет собой белок со специфичным доменом, связывающим антигены.

D Антигены—это молекулы, способные вызывать иммунный ответ.

Иммунный анализ использует уникальную специфичность антитела, связывающего антиген, с целью селективно распознать и определить вещества, которые являются или антителами, или антигенами. Можно добиться высокой селективности иммунного диализа, потому что другие соединения в пробе распознаваться не будут. Антитела представляют собой один из главных классов белков, объединенных названием иммуноглобулины (Ig). Внутри этого семейства наиболее представительными антителами являются IgG (~ 70%), Y-образный белок, состоящий из двух идентичных, связанных дисульфидными мостиками гетеродимеров с тяжелой и легкой цепями (рис. 7.9-1). Имеются два антигенсвязывающих (активных) центра, образованные вариабельными глобулярными доменами тяжелой и легкой цепей в Fab-области; специфичность этих центров к связыванию антигена определяется аминокислотами областей, определяющих комплементарность. В связывающей полости имеется максимум 17 аминокислот, так что активный центр антигена должен иметь размеры такого же порядка. Антиген не обязательно должен быть белком; это может быть любая макромолекула, которая способна индуцировать иммунный ответ и, таким образом, вызвать образования антител против нее. Молекулы с низкой молекулярной массой (такие, как гормоны или наркотики, являющиеся предметом анализа) не являются антигенными, но можно создать антитела с активными центрами, специфичными к этим молекулам, соединяя их с белковым носителем. Такие низкомолекулярные соединения известны как гаптены.

Антитела продуцируются В-лимфоцитами, причем каждая В-клетка проявляет на своей поверхности только одну специфичность, так что инородный антиген связывают только клетки с «подходящими» активными центрами. Это связывание стимулирует деление таких клеток и образование большого количества IgG с той же специфичностью. Активный центр может быть лишь небольшой частью всей молекулы антигена, и, таким образом, у одного и того же антигена может быть несколько потенциальных активных центров. Результатом этого процесса становится образование сыворотки, содержащей неоднородную смесь частиц антител с разнообразным сродством. Такие сыворотки известны как поликлональные и, в отличие от моноклональных антител, в их кинетику распознавания вносит свой вклад каждый из активированных распознающих центров или эпитопов.

Рис. 7.9-1. Структура тяжелых (индекс Н) и легких (индекс L) цепей IgG, показывающая места связывания антигена.

При сближении антитела (Аb) и антигена (Ag) первичная связывающая сила является ионной (дальнее взаимодействие), действующей на расстояниях свыше 10 нм. Медленное удаление гидратационной воды приводит к образованию водородных связей на расстояниях 0,5-0,15 нм, силы Ван-дер-Ваальса (ближнее взаимодействие) между диполями на соседних атомах становятся более значимыми и связь упрочняется. Связывание можно описать с помощью равновесия:

(7.9-1)

где К_равн — константа равновесия, a Ab-Ag — комплекс антитело-антиген. Значения K_равн обычно изменяются в диапазоне от 10⁶ л/моль до 10¹² л/моль, но значения меньше, чем 108 л/моль, как правило, в иммунном анализе не используют.

Определяя общую концентрацию антител [Аb_oбщ] как сумму концентраций связанных [Ab-Ag] и свободных [Аb] антител:

(7.9-2)

можно переписать уравнение 7.9-1:

(7.9-3)

Рис. 7.9-2. График Скэтчарда для моноклонального (а) и поликлонального (б) антитела.

На графике Скэтчарда строят зависимость отношения от [Ab-Ag], где Кравн определяется наклоном, а отсекаемый на оси х отрезок — [Аbобщ].

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: