Главная | Случайная
Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Конкурентный анализ




Конкурентный иммунный анализ включает конкуренцию между определяемым веществом пробы и меченым определяемым веществом за ограниченное число активных центров.

В конкурентном иммунном анализе устанавливают число центров, не занятых пробой; он может иметь различные варианты, но суть в том, что определяемое вещество пробы смешивают с меченым определяемым веществом, и они конкурируют за активные центры (рис. 7.9-4). Метод требует разделения связанного и свободного антигена или антитела с целью определения их относительных количеств. Если определяют антиген, присутствие меченого антигена позволяет оценить относительное разделение. Как можно заключить из кривых на рис. 7.9-3, оптимальная чувствительность достигается при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела.

Рассмотрим сигналы компонентов в конкурентном анализе: сначала обсудим условия, когда проба отсутствует и сигнал, относящийся к связанным антителу-антигену в присутствии только меченого антигена, определяется уравнением

(7.9-7)

Рис. 7.9-4.Конкурентный анализ для тест-определения антител.

где 50бщ — сигнал, который был бы получен при прямом измерении [А§0бщ]-Сигнал неспецифического связывания 5НС — функция доли неспецифического связывания оставшегося свободного антигена.

(7.9-8)

где В„с— доля неспецифически связанного антигена. Таким образом, при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела с той целью, чтобы сместить динамический диапазон определений в область меньших концентраций, ошибки из-за неспецифического связывания начинают оказывать все большее влияние на точность определения. Каждое сочетание специфического и неспецифического связывания будет иметь свое оптимальное сочетание концентраций антитела и меченого антигена. Полное устранение неспецифического связывания или разделение связанной и свободной фаз невозможно со 100%-ной эффективностью, так что концентрацию антитела, вообще говоря, следует увеличивать, чтобы увеличить вклад специфического связывания. В присутствии только меченого антигена 5о определяют по уравнению деляется степенью связывания. Однако в присутствии пробы (немеченого антигена) :

(7.9-9) (7.9-10) (7.9-11)

где — антиген пробы, а — меченый антиген.

Для данной концентрации меченого антигена сигнал связанного антигена Ag* уменьшается при небольшой добавке антигена пробы (немеченого) [AAg*].

Из кривых на рис. 7.9-5 очевидно, что изменение сигнала в результате [ДА§*] является функцией концентрации антитела, используемой в анализе (рис. 7.9-5,6), и что уровень антител, дающий максимальную чувствительность, зависит от концентраций меченого и определяемого антигена. Традиционно системы иммунного анализа имеют тенденцию давать погрешность при высокой концентрации реагента со степенями связывания 0,4-0,5. Действительно, из рис. 7.9-3,а и б, видно, что связывание в этой области (0,4-0,5) слишком велико, чтобы привести к большому изменению степени связывания антигена при низкой концентрации последнего. Однако нельзя игнорировать сигнал, относящийся к неспецифическому связыванию, поэтому чувствительностью поступаются в пользу более низких помех за счет неспецифического связывания при более высоких концентрациях антител.

Хотя конкурентный вариант иммунного анализа имеет свои преимущества и очень популярен, он имеет и практические ограничения. Очевидным недостатком является то, что маркирование определяемого вещества Ag* может изменить или даже полностью устранить способность связываться с АЬ; вторая опасность особенно существенна, если маркирование включает в связывание критический эпитоп. Если кинетика связывания меченого и немеченого антигена различается, это следует учитывать в расчетах. Иногда, особенно при использовании меченых гаптенов, метка может улучшить распознавание. Это видно, когда меченый конъюгат использует то же положение на гаптене, что и ранее используемое в белковом носителе, требуемом для получения антител.

 

Рис.7.9-5. а — кривая разбавления антитела для меченого антигена Ag* и влияние добавления небольшого количества немеченого антигена Ag*; б — изменение связывания ДЬ вследствие добавки AAg* при Различных игхояных гтрттрнях гнязыва.ния.

Сандвичевый анализ

В Сандвичевом иммунном анализе определяемое вещество из пробы захватывается избытком антител, а количество захваченного определяемого вещества оценивают с помощью второго антитела, образующего, таким образом, сандвич.

Как упомянуто ранее, место распознавания на антигене представляет собой небольшую зону, поэтому может быть несколько различных эпитопов, которые пространственно разделены на антигене. Эту особенность можно использовать в «Сандвичевом» анализе; определяемое вещество захватывается антителом Abl, что позволяет выделить его из остальной пробы. Захваченный антиген затем выдерживают с избытком второго, меченого антитела АЬ2, которое связывается только с уже существующими комплексами антитело-антиген (рис. 7.9-6).

Меченое антитело Аb2 должно быть способно специфически соединяться с поверхностью связанного антигена. В идеальном случае сандвичевого анализа в отсутствие меченого антитела нет никакого сигнала. На практике всегда есть некоторый сигнал, возникающий за счет неспецифического связывания Аb2 с Аb1, так что даже в отсутствие общего сигнала:

(7.9-12)

где 50бщ — сигнал, возникающий за счет

В присутствии слоя Аb1 связывание Ag описывается константой KpaBai в соответствии с уравнениями 7.9-1-7.9-6 (где Аb1 = АЬ и КрАВ„1 = Кравя), но затем его контролируют с помощью присоединения АЬ2 к связанному антигену Agb, описываемого константой -Кравн 2'-

(7.9-13)

Контролируемый сигнал для связанного (АЬ2ь) и свободного (АЬ2/) меченого антитела должен различаться. Обычно измеряют связанное антитело, так что уравнение 7.9-13 означает, что будет полезлым использовать избыток АЬ2, при котором соблюдаются условия

(7.9-14) и уравнение 7.9-13 преобразуется в

(7.9-15)

Однако существует оптимальная концентрация меченого антитела. Более

высокие концентрации увеличивают неспецифическое связывание с захвачен- а к ч

Рис. 7.9-6.Иммунометрическое . (санд-вичевое) определение антигена.

Рис. 7.9-7.Разделение связанной и свободной фракций с использованием избытка антигена на твердой фазе.

С другой стороны, концентрация АЫ не влияет на чувствительность до тех пор, пока его количества хватает для захвата антигена пробы (как правило, в концентрации больше чем ~ 10~9 моль/л, но обычно выбирают ~ 10~6 моль/л, чтобы попасть в область постоянной степени связывания > 90%).

Варианты устройства

Общее рассмотрение

В последнем разделе были очерчены основные теоретические принципы, но можно разработать почти неограниченное число вариантов связывания активных центров последовательностей и сандвичей, которые в конечном итоге достигают одной цели, а именно оценки концентрации определяемого вещества! Общими чертами классических методов иммунного анализа является то, что они определяют содержание не напрямую, а с помощью меченого аналога определяемого вещества или меченой системы распознавания определяемого вещества. Они также требуют разделения сигналов от свободного и связанного меченого маркера; это требование является первостепенным в иммунном анализе.

Разделение связанной и свободной фракций можно провести различными способами. В жидкофазном анализе растворов используют осаждение, центрифугирование и декантацию, но они дают весьма непостоянные результаты и поэтому не нашли широкого применения. Первый большой успех в этом направлении сделали Майлс и Хейлс (1968), которые предложили удалять несвязанные меченые антитела, вводя большой избыток антигена в твердой фазе (рис. 7.9-7).

Эта разработка положила начало развитию твердофазного иммунного анализа, в котором, однако, возникают дополнительные трудности, особенно в аспекте термодинамики взаимодействий. Твердофазный анализ отличается от анализа в жидкой фазе как по реакционной способности иммобилизованного антитела или антигена, так и по различию кинетики реакций в растворе и реакций, включающих твердую фазу (см. также разд. 7.8).




Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2018 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных