Главная

Популярная публикация

Научная публикация

Случайная публикация

Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Адсорбция на твердых частицах




Иммунный анализ может быть гомогенным, т.е. проводиться в жидкой фазе, или гетерогенным, когда один из реагентов присоединен к твердой фазе.

Белки имеют тенденцию адсорбироваться на различных материалах, это свойство можно использовать для разделения. Целлюлоза, стекло и силика-гель —все они нашли применение для адсорбции белков. Классический способ удаления растворенного вещества из раствора — использование измельченного древесного угля, но в случае белков IgG адсорбция затрудняется из-за несоответствия между большим размером молекул белка и малыми порами угля. Древесный уголь модифицируют, покрывая его декстраном и IgG, и в растворе сохраняется комплекс IgG-антиген, тогда как антиген адсорбируется на древесном угле. В случае меченого антигена этим способом удаляют из раствора свободную метку, оставляя связанную метку для определения в растворе.

В некоторых случаях адсорбция антигена на древесном угле может стать конкурентным процессом, нарушающим равновесие. В любом случае ее мож

но использовать лишь тогда, когда конъюгат антиген-метка достаточно мал, чтобы обеспечить эффективное разделение.

Хроматография

Во многих определениях существует значительная разница в размерах рецептора и лиганда. Антитела имеют молекулярные массы порядка 160000 и могут быть легко отделены от антигенов с молекулярной массой менее 80000. Наиболее широко для этой цели применяется эксклюзионная гель-фильтрующая хроматография. Небольшой свободный меченый антиген удерживается на колонке, в то время как объемистый комплекс антиген-антитело элюируется. Метод обеспечивает хорошее разделение, но он дорог и требует затрат времени, так что он не подходит для рутинного, многократного использования.

Твердофазные носители

В этих методах первичная распознающая система присоединена к твердому носителю. Общим свойством этих методов является их низкое неспецифическое связывание, сравнимое с жидкофазным анализом, особенно при введении этапов промывки для уменьшения неспецифичных эффектов. Выбор метода опять-таки зависит от факторов целесообразности и технических характеристик. Возможные компромиссные варианты приведены в табл. 7.9-1.

Шарики и частицы

Для твердофазной иммобилизации более всего подходят стеклянные шарики. IgG адсорбируется либо на стеклянную, либо на пластиковую поверхность, так что это метод пассивной иммобилизации, оптимальный при нейтральном рН. Высокую загрузку белка получают при таких размерах частиц, которые обеспечивают адсорбцию 10-15% белка из раствора. Используют также кова-лентное присоединение, но это обычно требует большей подготовки иммобилизованного слоя (химия связывания подобна изображенной на рис. 7.8-7 и 7.8-8). Потребность в этом определяется приложением и дальнейшей обработкой иммобилизованного IgG.

Диаметр частицы не обязательно напрямую определяет емкость связывания, поскольку она зависит также от площади и природы поверхности. Однако установлено, что сефадекс и целлюлоза обычно имеют более высокую емкость связывания, чем найлон, полистирол или стекло, хотя два последних можно легко приготовить в виде более мелких частиц.

Твердофазными носителями могут быть частицы произвольной формы, шарики и поверхности; площадь реагирующей поверхности оказывает влияние на емкость связывания.

Среди сыпучих материалов наиболее распространен латекс (диаметр < 20 мкм) благодаря его сферической геометрии и большой удельной поверхности. Его плотность близка к плотности воды, так что на протяжении анализа он остается во взвешенном состоянии. Разделение осуществляют затем с помощью центрифугирования, декантации, микрофильтрации и т. п. Однако

успешное применение этого материала для иммобилизации имело своим результатом изобретение и других оригинальных методов разделения. Например, инклюзия оксида железа (Робинсон с сотр., 1973) или оксида хрома приводит к парамагнитному материалу, поэтому частицами можно управлять с помощью магнитного поля.

Для более крупных частиц и шариков, которые обычно не находятся во взвешенном состоянии, можно использовать такое парамагнитное легирование и наложение магнитного поля, чтобы поддерживать движение шариков в течение инкубационного этапа.

Мембранное фильтрование

В этом методе пробу «фильтруют» через мембрану, в которой иммобилизована захватывающая молекула (антитело или антиген). Затем в фильтрате определяют несвязанное вещество. Использование волоконных мембран увеличивает площадь поверхности, а значит, и емкость связывания; используют стекловолокно и волокно целлюлозы, но чаще материалом мембраны служит найлон. Улучшение взаимодействия может быть получено при иммобилизации захватывающей молекулы на частицах полимера (как описано выше), которые затем улавливают в мембране.

Иммунохроматография

Дальнейшим развитием этих идей является включение захватывающей молекулы в полоску в хроматографической системе. В большинстве систем, использующих этот вариант, захватывающую молекулу (например, антитело) иммобилизуют на хроматографическом носителе (бумага, кремнезем, полимер или гель и т. д.) и фиксируют в виде полоски, так что проба (антиген), смешанная с меченым антигеном, конкурентно реагирует за захват мест распознавания, по мере того как проходит по полоске. Несвязанный материал затем можно определить, так как он мигрирует за захватывающую полоску. Другой способ — оценка количества меченого антигена, захваченного в полоске.

Разработаны также другие варианты: например, захватывающую полоску можно расширить на всю длину хроматографической системы, так что измерение основано на определении длины, на которой захватывается меченый антиген. Она связана с общей концентрацией антигена, а поскольку концентрация меченого антигена, добавленного к пробе, всегда одинакова, то для данной поверхностной плотности иммобилизованных захватывающих антител эта длина зависит от концентрации антигена в пробе.

Пластины, каналы и трубки

Пожалуй, наиболее удобной поверхностью для иммобилизации в рутинном иммунном анализе являются полистирольные микротитрующие пластины, трубки и каналы. Однако эффективность их использования в значительной мере зависит от воспроизводимости взаимодействия. Для увеличения емкости связывания и улучшения воспроизводимости разработаны способы облучения и химической обработки поверхностей, за счет чего матрицы микротитрующих каналов массового производства улучшили воспроизводимость «идентичных»

поверхностей для сравнительной иммобилизации, так что в анализе легко провести градуировку и автоматизацию, по крайней мере, частичную. Разработаны очень многие конкурентные или сандвичевые методы, использующие эти поверхности, покрытые антителом или антигеном.

Основным недостатком, особенно в случае микротитрующих пластин, является малая площадь поверхности для реакции. Пластины имеют емкость порядка 10% от емкости трубок, так что измеряемый при анализе сигнал должен быть достаточно велик, чтобы работать с этими малыми количествами. Независимо от этих ограничений, определения как с трубками, так и с пластинами проводили весьма успешно главным образом благодаря простоте их использования, а не благодаря характеристикам сигнала.

В качестве материала наиболее широко используют полистирол, а в некоторых случаях увеличивают емкость за счет высушивания на нем антитела; одним из главных достоинств является высокая степень адсорбции, несмотря на то, что площадь поверхности мала по сравнению с площадью частиц, обсуждавшихся выше. Однако это преимущество в адсорбции способствует также неспецифическому связыванию, так что определение всегда включает этап «блокировки», использующий белок, такой, как казеин, для связывания любых ненаселенных областей на поверхности полистирола после того, как была присоединена первичная распознающая молекула.






Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2024 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных