Физические методы разделения связанной и свободной метки

Разделение связанной и свободной метки не должно нарушать равновесия между ними.

Идеальный метод разделения не должен оказывать влияния на соотношение связанной и свободной метки и должен обеспечивать полное разделение обеих форм. Однако, как было установлено ранее, достичь этого никогда не удается. В любом случае связывание рецептор-лиганд обратимо, поэтому процедура разделения не должна изменять условия реакции, чтобы диссоциация не происходила. Большое разнообразие применяемых методов разделения отражает разнородность свойств комплекса рецептор-лиганд и требований к ме-

Рис. 7.9-8. а — образование граничного слоя; б — эффекты фрактальной геометрии.

тоду анализа. Например, основным требованием может быть скорость и простота использования, а не чувствительность или воспроизводимость. Может требоваться количественный результат, либо результаты по принципу «да-нет». Все эти критерии меняют общую схему анализа, и метод разделения связанной и свободной метки в анализе должен отражать эти потребности.

-Жидкая фаза

Декантация

По сути дела это простейший метод разделения; подходит и любой другой из подобных методов (процеживание, удаление жидкости и т. д.), но на практике их применение может быть связано с трудностями; для получения адекватных результатов каждый анализ требует модификации системы и методики.

Осаждение

Осаждение иммуноглобулинов легко осуществить «высаливанием» при нейтральном рН, при котором они малорастворимы, так что в случае меченого антигена связанную метку можно осадить из раствора вместе с оставшимся свободным антителом, оставляя, таким образом, свободную метку на поверхности. В качестве соли предпочитают использовать сульфат аммония, но недостатком метода в таком случае является высокий уровень неспецифического связывания.

Лучшим осадителем служит полиэтиленгликоль (ПЭГ). Его действие подобно действию соли, отбирающей воду из структуры IgG и вызывающей ее денатурацию, в результате чего и происходит осаждение из раствора, но ПЭГ обеспечивает лучший контроль над системой. Метод широко используют в определениях ряда гормонов и стероидов различного типа, в ситуациях, когда гаптеновый антиген остается в растворе в условиях осаждения белка.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: