Антитела могут быть моноклональными или поликлональными.

Сыворотка с единственным эпитопом специфичности представляет моноклональную систему. На соответствующем графике Скэтчарда наблюдается прямая линия (рис. 7.9-2,а). Для поликлональной системы график Скэтчарда имеет более сложный вид. Он характеризуется набором многих прямых линий (рис. 7.9-2,5).

При разработке иммунного анализа целью является проследить за равновесием между антителом и антигеном. При анализе исследуют связывание антигена с антителом и различают связанный и несвязанный антиген. Поскольку процесс имеет равновесный характер (уравнение 7.9-1), линейной зависимости от концентрации антигена нет. Следовательно, важно знать характеристический отклик связывания как функцию концентрации антигена.

Из уравнения 7.9-1 и соотношения

(7.9-4) можем записать:

(7.9-5)

(7.9-6)

Кривые, построенные исходя из этого соотношения для различных концентраций антител, показаны на рис. 7.9-3,а. Можно заметить, что для данной концентрации антител степень связывания меняется как функция концентрации антигена только в критическом диапазоне. Ниже находится область постоянного пропорционального связывания, где изменения концентрации антигена дают незначительные изменения степени связывания. Из рис. 7.9-3,5 очевидно, что увеличение концентрации антител вызывает сдвиг области максимального изменения (т. е. потенциального динамического диапазона измерений) в область более высоких концентраций антигена.

Рис. 7.9-3. а — степень связывания в зависимости от концентрации антигена для различных концентраций антитела; б — степень связывания в зависимости от концентрации антитела для различных концентраций антигена; в — доля занятых центров антитела в зависимости от концентрации антитела для различных концентраций антигена.

С другой стороны, рис. 7.9-3,в показывает, что для довольно низких концентраций антител (< 0,01/Крави) доля занятых активных центров антитела отражает концентрацию определяемого вещества и становится независимой от общей концентрации антител. Однако это не используют широко, хотя подразумевается, что изучаемые концентрации столь малы, что обеднением пробы антигеном за счет связывания можно пренебречь, при этом преимуществом является независимость от объема пробы.

Для того чтобы изучать процесс связывания независимо от уровня концентрации, обычно вводят метку, которую можно контролировать. Пути выполнения этой операции (см. ниже) могут различаться, но при этом всегда следует учитывать ограничения, налагаемые равновесием связывания и необходимым динамическим диапазоном.

Варианты анализа

П Иммунный анализ основан на измерении доли занятых активных центров.

Любой иммунный анализ базируется на измерениях доли занятых активных центров. Другими словами, принцип анализа основан на определении доли занятых центров, или косвенно — доли незанятых центров. Как будет показано в этом разделе, рассмотрение доли занятых активных центров антител приводит к заключению, что, если измеряют оставшиеся незанятыми центры, максимальной чувствительности достигают, когда концентрация антитела стремится к нулю; варианты, удовлетворяющие этому условию, обычно называют «конкурентными». Напротив, методы, в которых напрямую измеряют занятые центры, требуют высоких уровней антител и называются «неконкурентными». Следует, однако, сознавать, что эти термины несколько субъективны, поэтому возникает парадокс, особенно для «неконкурентного» варианта, когда анализ может быть отнесен к любой из двух категорий в зависимости от выбранного этапа. Поэтому важно помнить, что эти довольно двусмысленные термины используют применительно к этапу первичного распознавания. Из-за различных условий оптимизации конкурентный и неконкурентный иммунный анализы могут значительно отличаться в выполнении для данного диапазона концентраций: эти различия следует рассматривать при выборе оптимального варианта для конкретного приложения.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: