Методы иммобилизации

Иммобилизация биораспознающего компонента может происходить в один или два этапа. Биораспознающая молекула может присоединиться непосредственно к поверхности преобразователя или модифицировать «несущий субстрат», который впоследствии, а иногда и одновремненно, осаждается на преобразователь.

Физическая адсорбция

П Физическая адсорбция характеризуется низкой энергией взаимодействия.

Физическая адсорбция биораспознающей молекулы на поверхности преобразователя является простейшим из процессов иммобилизации. Одним из наиболее распространенных адсорбентов для ферментных электродов служит углерод [7.8-5-7.8-8]. Весьма подходящую поверхность для оптического преобразования в анализе растворов обеспечивает полистирол. Однако физическая адсорбция очень часто слишком слабо удерживает реагент, который в результате быстро вымывается, поэтому сенсор следует покрывать мембраной, проницаемой для определяемого вещества и способной удерживать биораспознающие молекулы на преобразователе.

Физическое удерживание в полимерных матрицах

D Для создания полимерной матрицы, в которой удерживается реагент, можно использовать поперечно сшитые реагенты.

Распространенным методом удерживания ферментов и живых клеток является поперечное сшивание, при котором образуется гелевая матрица, где частицы рецепторов удерживаются физически. Методы получения этого «геля» многочисленны. Наиболее испытанный метод иммобилизации — это, пожалуй, поперечное сшивание с помощью глутарового альдегида, и он все еще предпочтителен для иммобилизации фазы реагента в проточно-инжекционном анализе, несмотря на проблемы с его осуществлением в большом масштабе. Во всяком случае, используются многие бифункциональные реагенты [келнер]

Модификация поверхности

D Реагент может присоединяться с помощью ковалентной связи или прямо к преобразователю, или к слою, нанесенному на преобразователь.

В этом способе подложкой может служить либо сам преобразователь, либо полимерный материал, который будет нанесен на преобразователь в последующей операции. Не все преобразователи имеют подходящие связывающие группы на поверхности, и поэтому часто лучше обеспечить связь с материалом, который впоследствии можно нанести на преобразователь. Большинстве из этих материалов — полимеры, например сополимеры малеинового ангидрида, сополимеры метакриловой кислоты/ангидрида и их производные [7.8-17-7.8-20], или другие поверхности со свободными группами -NH2, -SH, -СООЕ и т. п. Такие носители наносят на преобразователь в виде тонкого слоя. Реакционные группы, к которым будет присоединяться биораспознающая молекула, можно образовать на полимере с помощью дериватизации мономера сополимеризации или с помощью прямой реакции с полимером.

Многие другие поверхностные группы на подложке для иммобилизации перед ковалентным связыванием должны быть функционализированы. Привлекательными реагентами для функционализации поверхностных ОН-групг являются силановые связывающие агенты типа XsSiL или XS1R2L, где X-это гидролизуемая группа, a L — лиганд (или группа, которую можно превратить в лиганд); эти реагенты широко применяются, особенно на кремнеземе. Термическая и гидролитическая стабильность полученных на таких носителях связей высока.

Схема 7.8-3. Иммобилизация на поверхность, модифицированную силаном.

При проектировании желаемой модификации поверхности возможны два подхода:

а) связывающий агент присоединяется к носителю и затем реагирует с макромолекулой, которую нужно иммобилизовать (схема 7.8-3);

б) получают комплекс макромолекула-силан и затем осаждают его прямо на поверхность (схема 7.8-4).

Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. При наличии более одного поверхностного лиганда первый способ приводит к образованию неоднородного поверхностного продукта. Если же в макромолекуле более одной реакционной группы, то реакция с силаном приводит к получению смеси комплексов силан-макромолекула, а следовательно, и смеси продуктов иммобилизации. Первый подход, вообще говоря, предпочтительнее, поскольку набор лигандов можно легко расширить после присоединения с помощью стандартных органических реакций, которые сложно применить к самим связывающим реагентам X₃SiL.

Поверхностные ОН-группы часто используются и в других реакциях связывания (рис. 7.8-7,0-е), помимо них можно использовать и другие группы, например, амидо-, -СООН и т. д. (рис. 7.8-8). На поверхности металлов, таких, как серебро и золото, особенно эффективным способом создания полезных функциональных групп для иммобилизации стало использование самоорганизующихся слоев, таких, как тиолы с длинной цепью, имеющие концевую группу для связи с распознающей молекулой. В случае иммобилизации ДНК концевая МЩ-группа обеспечивает связывание через тиминовое кольцо. Многие другие соединения структуры Y(CH₂)_nX, имеющие две концевые функциональные группы, разделенные гидрофобной цепью (разделитель), самоорганизуются на поверхности в соответствии с реакционной способностью функциональных групп. Если для реакции с поверхностью выбран Y, тогда упорядоченный слой, включающий разделитель, можно получить в одш этап.Можно вводить различные функциональные группы, при условии что они не будут конкурировать с головной группой Y за координацию с подложкой и не будут столь велики, чтобы препятствовать плотной упаковке углеводородных цепей.

П Материалы, которые были модифицированы реагентами, следует аккуратно нанести на преобразователь.

В электронной технике нанесение и разрешение слоев осуществляют предельно тщательно. Технологии толстых и тонких пленок стали инструментом для получения миниатюрных электронных приборов. Известен целый ряд доступных методов, пригодных для нанесения на преобразователь слоев, содержащих биораспознающий компонент.

Экранную печать — метод получения толстой пленки — можно использовать для нанесения ряда электродных материалов (включая углерод и благородные металлы), а также биораспознающих слоев, медиаторов или защитных покрытий. Обычно точность нанесения поддерживается в пределах 500 мкм, хотя для определенных материалов имеются сообщения о 100 мкм.

Струйная печать может выдавать отдельные капли проводящего раствора, например, буферного раствора белка, со скоростью до 50000 капель в секунду. Размер капель можно варьировать от 0,3 до 1,5нл, что дает разрешение 1-5 мкм в зависимости от поверхностного натяжения жидкости и гидрофобно-сти и абсорбции подложки, на которую эту жидкость наносят.

Обычные фоторезисторы можно наносить с разрешением, достигающим 250 нм при использовании источника света 350-450 нм или менее 100 нм при использовании электронного пучка. Однако при получении слоев белок/полимер реальное разрешение фотолитографии оценивают более чем в 150 мкм из-за рассеяния света, индуцированного белком.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: