Задание 1. Определение амилазы в слюне методом Вольгемута (по реакции крахмала с йодом).

Принцип метода. Метод Вольгемута основывается на способности амилазы расщеплять (гидролизовать) крахмал. В ходе работы выявляют минимальное количество фермента, способного полностью расщеплять 1 мл 0,1 %-го раствора крахмала. Это количество фермента принимают за единицу амилазной активности.

Амилазная активность выражается в количестве 0,1 %-го раствора крахмала в миллилитрах, которое может гидролизовать 1 мл слюны при температуре 37^оС в течении 30 мин. В норме амилазная активность слюны – А = 160 – 320 единиц.

Ход работы. В семь пронумерованных пробирок вносят из бюретки по 1 мл воды. В первую пробирку добавляют 1 мл разведённой в 10 раз слюны. Содержимое тщательно перемешивают и 1 мл полученного раствора переносят из первой пробирки во вторую, из неё – в третью, таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Потом во все пробирки добавляют по 2 мл 0,1%-го раствора крахмала, перемешивают и ставят пробирки на водяную баню (или термостат) при 37°С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают для завершения действия фермента. В каждую пробирку добавляют по 2 капли раствора йода (0,1%-й раствор йода в 0,2%-м растворе йодида калия), перемешивают и наблюдают за изменением окраски. Жидкость в пробирках может окрашиваться в желтый, красный и синий цвета. Желтый цвет свидетельствует о полном расщеплении крахмала. Результаты наблюдений вносят в таблицу, обозначая синее, красное и желтое окрашивание “С”, “К”, “Ж”. Отмечают последнюю пробирку с раствором желтого цвета и проводят расчёт амилазной активности слюны:

Расчёт. Для расчёта активности амилазы необходимо знать разведение слюны в последней пробирке, где произошёл полный гидролиз крахмала.

Например, последняя пробирка с раствором жёлтого цвета является четвертой, в ней слюна разведена в 160 раз. Составляют пропорцию и рассчитывают активность амилазы:

1/160 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1 %-го раствора крахмала;

1мл слюны расщепляет - Х мл 0,1 %-го раствора крахмала,

откуда X= ^{1 ×2} = ^2×160 = 320 мл

^{1/160 1}

Следовательно: А (амилазная активность) = 320 единиц.

Клинико-диагностическое значение. Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи.

Повышение активности амилазы в крови отмечается при панкреатите, перитоните, тромбозе сосудов, вследствие введения в организм ряда физиологически активных соединений, в частности морфина, кодеина, кортикотропина (АКТГ) и кортизола.

Повышение активности амилазы слюнных желез наблюдается при стоматите, невралгии лицевого нерва, почечной недостаточности, паркинсонизме. Снижение активности амилазы крови наблюдается при психических заболеваниях, анацидных состояниях.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: