Определение бактериальной обсемененности с использованием биолюминесцентного экспресс-метода

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего света и на непродолжительное время переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. Обратный переход в нормальное состояние сопровождается отдачей избытка энергии в виде света – люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают УФ-лучами длиной волны 300-400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400-460 нм. Способностью к люминесценции обладает АТФ (аденозин-5¹-трифосфат), содержание которого зависит от количества бактериальных клеток. Измерение люминесценции микробной АТФ производят на приборах –люминометрах /1.1/.

Измерительный комплекс прибора представляет собой сочетание люминометра и специальных реактивов. Люминометр детектирует интенсивность излучения, возникающего в ходе реакции биолюминесценции (относительные световые единицы – RLU), которая прямо пропорциональна количеству АТФ. АТФ содержится во всех живых клетках – растительных, животных и клетках микроорганизмов, и именно поэтому АТФ является интегральным показателем чистоты. Люминометр выдает результат в течение 1 мин, что дает возможность внести коррективы перед пуском производственной линии, то есть работать в режиме online. К достоинствам метода определения АТФ, кроме быстроты, можно отнести высокую чувствительность, воспроизводимость результатов и простоту, так как он не требует пробоподготовки.

Метод АТФ-тестирования можно использовать как экспресс-метод определения качества санитарной обработки оборудования, чистоты рук персонала. Кроме того, данный метод можно использовать также для определения соматических клеток в молоке, бактериальной обсемененности сырого молока и воды, колиформных бактерий в пищевых продуктах и воде, остаточных количеств некоторых групп антибиотиков (бета-лактамов, левомицетина, клоксациллина, тетрациклина, сульфамидов).

Люминометр «System Sure II» представляет собой экспресс-систему микробиологического анализа методом АТФ-биолюминесценции и состоит из измеряющего аппарата «System Sure II» и тест-системы «Ultrasnap ATP для взятия проб, содержащей набор биолюминесцентных реагентов, за исключением АТФ, необходимых для протекания люциферазной реакции.

Принцип работы люминометра основан на измерении количества АТФ - химического вещества, присутствующего во всех живых клетках, в том числе микробных, посредством использования тест-системы, содержащей фермент люциферазу, которая усиливает реакцию между люцифирином и АТФ микробной клетки и дает эффект свечения, пропорциональный степени загрязненности образца.

Отбор проб с помощью тест-системы «Ultrasnap ATP». Тест-система «Ultrasnap ATP» для взятия проб состоит из полимерной пробирки с вставленным в нее полым стержнем, на верхней стороне которого находится полимерная груша с биолюминесцентным реагентом, на нижней стороне - тампон для протирания поверхностей.

Отбор проб для исследований проводят с соблюдением правил асептики. Смывы берут с поверхности площадью приблизительно 100см² стерильным увлажненным тампоном, расположенным на конце полой трубки,

Аппарат имеет следующие технические особенности, представленные на рисунке 1.4.

1 - крышка аппарата; 2 - жидкокристаллический экран; 3 – клавиатура; 4 - лицевая этикетка; 5 - место для закрепления шнурка; 6 - табличка серийного номера; 7 - место для батареек; 8 - крышка соединителя RS 232; 9 - защитный карман и пространство для вставки образца

Рисунок 1.4 – Описание люминометра «System Sure II»

удерживая ее за полимерную грушу. После взятия смыва полимерную трубку с тампоном вновь помещают в полимерную пробирку. До активации тест-системы «Ultrasnap ATP» проба может храниться в пробирке до 4-х часов, после активации ее необходимо помещать в люминометр не позднее чем, через 60 секунд.

Для проверки жидких проб, таких как вода, тампон необходимо погрузить в пробу на 5-10 секунд.

Активация тест-системы «Ultrasnap ATP» происходит путем нагибания полимерной груши вперед и назад несколько раз.После 2-х кратного нажатия на грушу, биолюминесцентный реагент, находящийся в ней стекает по полой полимерной трубке вниз пробирки, смачивая тампон.Для лучшего увлажнения тампона реагентом, пробирку встряхивают в течение 5-10 секунд.

Измерение оптических параметров с помощью люминометра. Перед измерением оптических параметров люминометр после включения осуществляет внутреннюю самокалибровку в течение 60 секунд. Во время самокалибровки в приборе не должно быть тест-системы и крышка устройства должна быть закрыта. После завершения автоматической самокалибровки прибор готов для выполнения измерений.

Для измерения оптических параметров активированную тест-систему «Ultrasnap ATP» строго вертикально вставляют в люминометр, закрывают крышку и нажимают кнопку «ОК» на передней панели прибора. Измерение оптических параметров проводят не позднее, чем через 60 секунд после взятия пробы. Считывание результата измерений осуществляют в течение 60 секунд периода активации.

Результаты измерений оптических параметров при тестировании методом АТФ-биолюминометрии выражаются в относительных световых единицах (RLU) и показывают общее количество света, испускаемое в пробе в результате реакции биолюминесценции (формулы 1, 2).

1 RLU = 1 fmol, (1)

1 fmol = 10¹⁵М, (2)

где RLU - относительная световая единица;

fmol - фемтомоль вещества;

М - моль вещества.

Порядок проведения микробиологического исследования с применением люминометра схематически представлен на рисунке 1.5.

Рисунок 1.5 – Порядок проведения микробиологического исследования с применением люминометра

Оценку полученных результатов испытаний проводят с не установленными пороговыми значениями или с установленными пороговыми значениями.