Тепловая денатурация

Почти все белки денатурируют при нагревании (исключением является, например, желатин). Этот процесс носит необратимый характер. Температура денатурации для разных белков различна. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в тепловой денатурации белков. Наиболее быстрая коагуляция наблюдается в изоэлектрической точке (для большинства белков это слабокислый раствор). В нейтральных и сильнокислых растворах осаждение таких белков происходит значительно хуже, а при высоком значении рН вовсе не наблюдается (исключение – оснóвные белки). Добавление к раствору белка нейтральных солей облегчает и ускоряет коагуляцию белков при нагревании вследствие дегидратирования белковых молекул.

Осаждение белков

В растворе молекулы белка вступают во взаимодействие со многими соединениями (кислотами, ионами металлов, спиртами и так далее), а также конкурируют с ними и друг с другом за молекулы растворителя (воды). Во многих случаях результатом этих процессов является выпадение белков в осадок. Осадки белков можно получить путем обратимого или необратимого осаждения, изменяя параметры факторов, стабилизирующих молекулы белка (температуру, заряд молекулы, величину гидратной оболочки и др.).

Концентрированные минеральные кислоты (кроме H₃PO₄) вызывают необратимое осаждение белков из растворов, что связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка. Избыток минеральной кислоты, за исключением азотной, растворяет выпавший осадок белка, полностью разрушая, «сжигая» белок. Поэтому за осаждением белка при использовании HCl и H₂SO₄ наблюдают на границе раздела фаз между белковым раствором и кислотой, где химическое воздействие последней минимально. Азотная кислота не разрушает белки, а модифицирует их, поэтому при ее избытке осадок сохраняется и приобретает характерный для нитросоединений желтый цвет.

Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами, однако разные органические кислоты неодинаково действуют на белок. Трихлоруксусная (ТХУ) и сульфосалициловая кислоты являются очень чувствительными и специфическими реагентами на белок и, поэтому, находят широкое применение в биохимических лабораториях. ТХУ часто применяется для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови). При этом продукты их распада остаются в растворе. Это особенно важно в тех случаях, когда нужно отдельно определить азот белка и азот низкомолекулярных соединений: аминокислот, мочевины и др. (так называемый «небелковый азот»). После осаждения белка ТХУ легко удаляется из фильтрата при кипячении, поскольку она разлагается с образованием летучих соединений – хлороформа и угольного ангидрида.

Многие органические растворители осаждают белки из нейтрального или слабокислого раствора. При добавлении к водному раствору белка определенной концентрации спирта или ацетона (осаждающие концентрации растворителей различны для разных белков) происходит выпадение белка в осадок. Осаждающее действие этих растворителей определяется дегидратацией молекул белка, что ведет к снижению их устойчивости в растворе. Если процесс осаждения проводить на холоду и полученный осадок быстро отделить от растворителя, то белок может быть снова переведен в раствор в водной фазе. Осаждение белков происходит при использовании некоторых других органических растворителей, например, фенола или формалина. Действие последних вызывает денатурацию белка вследствие дестабилизации водородных связей в молекуле полипептида.

Соли тяжелых металлов (Hg⁺², Ag⁺, Cu⁺², Pb⁺² и др.) вызывают необратимое осаждение белков за счет образования с ними нерастворимых в воде комплексов. В этом случае восстановление исходных свойств белков невозможно даже после удаления солей диализом или в результате сильного разбавления системы водой. Поэтому белки часто применяют в качестве противоядия при отравлении, например, солями ртути (сулема). Тем не менее, некоторые из таких осадков (при действии солей меди, свинца, цинка) растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции ионов металлов на поверхности белковых частиц: в результате этого белковые молекулы приобретают заряд и вновь переходят в раствор. Растворение осадков денатурированных белков при избытке солей тяжелых металлов называется адсорбционной пептизацией.

Растворы белков могут образовывать осадки при добавлении, так называемых алкалоидных реагентов. К последним относят таннин, пикриновую кислоту, некоторые другие вещества. Они представляют собой азотистые основания, содержащие различные гетероциклы с атомами азота. Способность белков осаждаться алкалоидными реагентами объясняется наличием сходных азотистых группировок в белках (имидазольные, пирролидиновые и др.) и в алкалоидах. Механизм осаждения белков алкалоидами заключается в образовании нерастворимых солеобразных соединений с оснóвными азотистыми группами. В таких комплексах белок выступает в роли катиона, алкалоид – аниона. Поэтому осаждение белков алкалоидами проводят в кислой среде (в этом случае молекулы белка перезаряжаются и переходят в состояние катионов). В щелочной среде осадки растворяются. Протамины и гистоны осаждаются в нейтральной среде.

Высаливание белков

Процесс высаливания основан на способности ионов солей связываться с коллоидными частицами белка и нейтрализовывать их заряд. Также важным фактором является разрушение гидратной оболочки белков. Из-за различий в зарядах и размерах разные белки осаждаются разными концентрациями солей. Например, глобулины имеют большую молекулярную массу и осаждаются 50% (NH₄)₂SO₄, а альбумины – 100% (NH₄)₂SO₄ (см. раздел «Ход работы»). Сульфат аммония обладает резко выраженной высаливающей способностью и осаждает белки, как в нейтральной, так и в слабокислой среде. Другие соли, например, хлорид натрия или сульфат магния, вызывают полное осаждение белков только при подкислении раствора. Высаливание белков является обратимым процессом. При уменьшении концентрации соли в растворе (например, при добавлении воды) происходит растворение выпавшего осадка белка.

Контрольные вопросы

1. Системы классификации белков

2. Белки: основной принцип строения.

3. Функции белков.

4. Уровни структурной организации белка. Надмолекулярные белковые комплексы.

5. Физико-химические свойства белков. Денатурация, осаждение и высаливание белков.

Литература

1. Овчинников Ю. А., Биоорганическая химия, «Просвещение», М., 1987.

2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993.

3. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996.

4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998.

5. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

6. Ленинджер А., Основы биохимии, т.1, «Мир», М., 1985.

7. Чиркин А.А., Практикум по биохимии, «Новое знание», Минск, 2002.

8. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д., Биологическая химия, «Бином», М., 2008.

9. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, «ОКФА», Одесса, 1994.

Дополнительная литература

4. Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2004.

5. Metzler D., Biochemistry, (The chemical reactions in living cells), Elsevier, Academic Press, V. 1-2, 2003-2004.

6. Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006.

Ход работы

* Определение изоэлектрической точки желатина по минимуму набухания

Сложные белки

Сложные белки состоят из полипептидных цепей, построенных из аминокислот, а также включают компоненты не аминокислотной природы, представленные кофакторами и простетическими группами. В зависимости от химической природы простетической группы сложные белки делят на несколько классов:

Хромопротеиды представляют собой сложные белки, состоящие из белковой части и связанного с ней окрашенного небелкового компонента – простетической группы. Различают железопорфирины или гемопротеиды (содержат в качестве простетической группы гем), магнийпорфирины и флавопротеиды. Хромопротеиды участвуют в таких процессах жизнедеятельности, как транспорт кислорода и углекислого газа, клеточное дыхание, окислительно-восстановительные реакции, фотосинтез, свето- и цветовосприятие.

Гликопротеиды – это сложные белки, простетическая группа которых представлена углеводами. Углевод соединяется с белковой частью ковалентными связями. В присоединении углеводного фрагмента принимают участие OH-группы остатков серина или треонина. Этим белкам принадлежит важная роль в структурной организации клеток и тканей, они также выполняют защитные функции (к гликопротеидам относятся иммуноглобулины).

Липопротеины. Простетической группой липопротеинов являются липиды. Такие липид-белковые комплексы обеспечивают транспорт липидов в крови, липопротеины являются компонентами биологических мембран. В образовании липопротеинов принимают участие гидрофобные или ионные взаимодействия, возникающие между белковой частью молекулы липопротеина и липидом.

Металлопротеиды. В данных белках простетическая группа представлена металлом. Эти сложные белки транспортируют или участвуют в депонировании соответствующих ионов металлов. В составе металлопротеидов простетическая группа образует с аминокислотными радикалами белка координационные связи. К наиболее известным представителям металлопротеидов относятся: а) ферритин, содержащий до 20% трехвалентного железа, выполняет функцию депо железа в организме. Основное количество ферритина содержится в печени и селезенке. Некоторая часть этого белка находится в плазме крови; б) трансферрин, содержит около 0,13% железа и выполняет роль переносчика железа, которое в молекуле белка непрочно связано с ОН-группой тирозина. Каждая молекула трансферрина связывает два иона двухвалентного железа. К металлопротеидам относят также ряд ферментов, в которых атом металла входит в состав активного центра и непосредственно участвует в выполнении катализа. Примерами таких металлопротеидов являются цинк содержащая карбоксипептидаза А, медь содержащая цитохромоксидаза, использующая для катализа селен глутатионпероксидаза, митохондриальная форма супероксиддисмутазы включающая ион марганца, цитозольная форма этого фермента включающая медь или цинк.

Фосфопротеиды. Простетической группой этих сложных белков является остаток ортофосфорной кислоты. Примерами ферментов, содержащих в активном центре остаток ортофосфорной кислоты, который принимает непосредственное участие в катализе являются фосфоглюкомутаза, обеспечивающая образование глюкозо-6-фосфата из глюкозо-1-фосфата, фосфоглицеромутаза превращающая 3-фосфоглицерат в 2-фосфоглицерат и дифосфоглицеромутаза обеспечивающая образование 2,3-дифосфоглицерата из 1,3-фосфоглицерата и 3-фосфоглицерата.

Присоединение или отщепление остатков фосфорной кислоты характерно для процессов фосфорилирования и дефосфорилирования белков, которые играют важную роль в системах регуляции метаболических путей. Этот механизм позволяет контролировать активность ряда жизненно важных ферментов. Примером может служить первый фермент, участвующий в мобилизации гликогена – гликогенфосфорилаза, которая обеспечивает фосфоролиз данного полисахарида в печени. Фосфорилирование одного из остатков серина обеспечивает активацию этого фермента, при отщеплении фосфатной группы происходит его инактивация. Во многих случаях цикл фосфорилирования/дефосфорилирования белков зависит от функции аденилатциклазной системы. Любое воздействие сАМР на такие процессы, как стероидогенез, секреция, транспорт ионов, метаболизм углеводов и жиров, индукция ферментов, регуляция транскрипции генов, рост и деление клеток регулируются активностью специфических протеинкиназ или специфических протеинфосфатаз, либо доступностью субстратов для фосфорилирования. Многие белки, в том числе казеин, гистоны и протамины могут также подвергаться фосфорилированию.

Нуклеопротеиды. Простетическая группа у таких белков – нуклеиновая кислота. Различают дезоксирибонуклеопротеины (простетическая группа – ДНК) и рибонуклеопротеины (простетичесая группа – РНК). Им принадлежит важная роль в хранении, передаче и реализации генетической информации. Между белком и молекулой нуклеиновой кислоты образуются ионные связи.

Выделение казеина

Наиболее доступным для изучения фосфопротеидом является белок молока – казеин. Вследствие присутствия фосфатной группы он обладает кислыми свойствами и в молоке находится в виде кислой кальциевой соли. Чаще всего казеин выделяют путем подкисления молока. Эта процедура основана на том, что казеин является гидрофобным белком, лишенным гидратной оболочки, поэтому в изоэлектрической точке (слабокислая среда) он становится крайне нестабильным и выпадает в осадок (см. лабораторную работу №2).

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: