Главная

Популярная публикация

Научная публикация

Случайная публикация

Обратная связь

ТОР 5 статей:

Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия

Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века

Ценовые и неценовые факторы

Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка

Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы

КАТЕГОРИИ:






Bacillus subtilis 23 29 страница




a =   m ln 2 ,  
       
NtN 0  
   
           

Використовуючи тест Лурія –Дельбрюка, можна обчислити значення m за часткою проб, у яких не відбулося жодної мутації Р0 за такою формулою:

 

m = −ln P 0,


 

тоді:


 

a = (ln P 0)(ln 2) .

 

NtN 0


 

Під час тестування слід враховувати такі фактори:

 

• вихідне число клітин, що їх висівають у незалежні культури, має бути невелике (для E. coli 10–100 клітин). Це зменшує ймовірність потрапляння в пробу висіву раніше виниклих мутантних клітин;

 

• тривалість росту і об'єм незалежних культур також мають бути обмежені. Потрібно пам'ятати, що у разі використання надто численних популяцій незалежних культур розходження між ними нівелюються через нагромадження великої кількості розподілених у часі мутацій;

 

• всі культури слід висівати однаковою кількістю клітин й інкубувати в ідентичних умовах.

Завдання на виконання

 

1. Для виконання роботи використовують культуру E. coli К12 Hfr, вирощену на повному середовищі концентрацією близько 2·109 клітин/мл (рис. 6.1). Для її одержання бактеріальні клітини висівають за 16 – 18 год на повному середовищі, інкубують при температурі 37 °С з аерацією. Кожен студент отримує 2 мл вихідної культури.

 

2. Для одержання незалежних культур з вихідної суспензії готують сім десятикратних розведень суспензії у фосфатному буфері. З останнього розведення відбирають пробу 0,1 мл і вносять у пробірку з 2 мл повного середовища,


 

 

0,5 мл 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
                         
                           

Вихідна

культура

E. coli, 2·109

кл./мл

 

Фосфатний буфер, 4,5 мл

 

10 Ч 0,1 мл

 

ПС по 2 мл,

 

інкубація 37° С,

 

18-24 год

 

 

ПА +

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

 

2Ч0,1

 

 

2Ч0,1

 

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

 

2Ч0,1

 

 

2Ч0,1

 

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

 

2Ч0,1

 

 

2Ч0,1


 

 

2Ч0,1 мл

 

 

2Ч0,1 мл

 

1 мл

 

 

10 мл

 

 

ПА  
ПА ПА + стрептоміцин

 

ПА

 

Фосфатний буфер, 4,5 мл Ч 6Ч 3

 

Рис.6.1. Схема постановки флуктуаційного тесту Лурія й Дельбрюка (ПА – повне агаризоване середовище)


 

пробірки вміщують у термостат з температурою 37 °С на 18 – 24 год. Для визначення концентрації життєздатних клітин у вихідній культурі (і, отже, для визначення кількості клітин, засіяних у незалежні культури) з шостого й сьомого розведень вихідної суспензії висівають три проби по 0,1 мл на дві чашки з ПА (всього шість чашок). Засіяні чашки розміщують у термостаті з температурою 37 °С на 24 год.

3. Із пробірок, засіяних з останнього розведення вихідної культури, проводять висів на повне агаризоване середовище зі стрептоміцином для визначення вмісту стійких до антибіотика клітин. Культури в перших десяти пробірках приймають за незалежні, в одинадцятій – за окрему. З незалежних культур висівають по одній пробі по 0,1 мл (всього десять чашок повного агаризованого середовища зі стрептоміцином). З одинадцятої пробірки висівають десять проб по 0,1 мл на десять чашок з ПА зі стрептоміцином. Кожну пробу по 0,1 мл відбирають окремою мікропіпеткою з максимальною точністю й розтирають на селективному середовищі окремим шпателем.

 

4. Слід ще визначити концентрацію життєздатних клітин у незалежних культурах. З цією метою проводять серійні розведення (до 10–7) із трьох довільно вибраних незалежних культур. Передбачається, що у всіх незалежних культурах за час інкубації виростає приблизно однакова кількість клітин. З п’ятого й шостого розведень кожної серії висівають по дві проби пo 0,1 мл на чашки з повним агаризованим середовищем (усього 12 чашок). Чашки інкубують при температурі 37 °С протягом 24 год, чашки з повним агаризованим середовищем і стрептоміцином – 48 годин.

 

Опрацювання результатів

 

1. Після пророщення культури в чашках Петрі проводять підрахунок вирослих колоній для визначення титру вихідної культури, і результати заносять у табл. 6.1.

 

  Концентрація клітин у вихідній і незалежній культурах Таблиця 6.1
     
               
Розве- Вихідна культура   Незалежна культура    
Кількість Концентра- Номер Розве- Кількість   Концен -
дення колоній у ція клітин пробірки дення колоній   трація
  чашках   клітин
           
               
               
               

 

2. Для визначення титрів незалежних культур і кількості стрептоміцинстійких клітин у пробах з незалежних і окремих культур рахують колонії, що виросли на чашках з повним агаризованим середовищем і на чашках з повним агаризованим середовищем і стрептоміцином. Результати підрахунку кількості життєздатних клітин у культурах вносять у табл. 6.2.


         
      Таблиця 6.2  
  Аналіз стрептоміцинстійких клітин  
         
  Кількість стійких до   Кількість стійких до  
Номер Номер стрептоміцину клітин у  
стрептоміцину клітин у  
проби культури пробах з незалежних  
пробах з окремої культури  
    культур  
       
         
         
         

 






Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

vikidalka.ru - 2015-2024 год. Все права принадлежат их авторам! Нарушение авторских прав | Нарушение персональных данных