Bacillus subtilis 23 29 страница

Використовуючи тест Лурія –Дельбрюка, можна обчислити значення m за часткою проб, у яких не відбулося жодної мутації Р₀ за такою формулою:

m = −ln P ₀,

тоді:

_{a =} ⁻(^{ln P} 0)(^{ln 2}) _.

N_t − N ₀

Під час тестування слід враховувати такі фактори:

• вихідне число клітин, що їх висівають у незалежні культури, має бути невелике (для E. coli 10–100 клітин). Це зменшує ймовірність потрапляння в пробу висіву раніше виниклих мутантних клітин;

• тривалість росту і об'єм незалежних культур також мають бути обмежені. Потрібно пам'ятати, що у разі використання надто численних популяцій незалежних культур розходження між ними нівелюються через нагромадження великої кількості розподілених у часі мутацій;

• всі культури слід висівати однаковою кількістю клітин й інкубувати в ідентичних умовах.

Завдання на виконання

1. Для виконання роботи використовують культуру E. coli К12 Hfr, вирощену на повному середовищі концентрацією близько 2·10⁹ клітин/мл (рис. 6.1). Для її одержання бактеріальні клітини висівають за 16 – 18 год на повному середовищі, інкубують при температурі 37 °С з аерацією. Кожен студент отримує 2 мл вихідної культури.

2. Для одержання незалежних культур з вихідної суспензії готують сім десятикратних розведень суспензії у фосфатному буфері. З останнього розведення відбирають пробу 0,1 мл і вносять у пробірку з 2 мл повного середовища,

Вихідна

культура

E. coli, 2·10⁹

кл./мл

Фосфатний буфер, 4,5 мл

10 Ч 0,1 мл

ПС по 2 мл,

інкубація 37° С,

18-24 год

ПА +

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

2Ч0,1

2Ч0,1

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

2Ч0,1

2Ч0,1

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

2Ч0,1

2Ч0,1

2Ч0,1 мл

2Ч0,1 мл

1 мл

10 мл

ПА

Фосфатний буфер, 4,5 мл Ч 6Ч 3

Рис.6.1. Схема постановки флуктуаційного тесту Лурія й Дельбрюка (ПА – повне агаризоване середовище)

пробірки вміщують у термостат з температурою 37 °С на 18 – 24 год. Для визначення концентрації життєздатних клітин у вихідній культурі (і, отже, для визначення кількості клітин, засіяних у незалежні культури) з шостого й сьомого розведень вихідної суспензії висівають три проби по 0,1 мл на дві чашки з ПА (всього шість чашок). Засіяні чашки розміщують у термостаті з температурою 37 °С на 24 год.

3. Із пробірок, засіяних з останнього розведення вихідної культури, проводять висів на повне агаризоване середовище зі стрептоміцином для визначення вмісту стійких до антибіотика клітин. Культури в перших десяти пробірках приймають за незалежні, в одинадцятій – за окрему. З незалежних культур висівають по одній пробі по 0,1 мл (всього десять чашок повного агаризованого середовища зі стрептоміцином). З одинадцятої пробірки висівають десять проб по 0,1 мл на десять чашок з ПА зі стрептоміцином. Кожну пробу по 0,1 мл відбирають окремою мікропіпеткою з максимальною точністю й розтирають на селективному середовищі окремим шпателем.

4. Слід ще визначити концентрацію життєздатних клітин у незалежних культурах. З цією метою проводять серійні розведення (до 10^–7) із трьох довільно вибраних незалежних культур. Передбачається, що у всіх незалежних культурах за час інкубації виростає приблизно однакова кількість клітин. З п’ятого й шостого розведень кожної серії висівають по дві проби пo 0,1 мл на чашки з повним агаризованим середовищем (усього 12 чашок). Чашки інкубують при температурі 37 °С протягом 24 год, чашки з повним агаризованим середовищем і стрептоміцином – 48 годин.

Опрацювання результатів

1. Після пророщення культури в чашках Петрі проводять підрахунок вирослих колоній для визначення титру вихідної культури, і результати заносять у табл. 6.1.

2. Для визначення титрів незалежних культур і кількості стрептоміцинстійких клітин у пробах з незалежних і окремих культур рахують колонії, що виросли на чашках з повним агаризованим середовищем і на чашках з повним агаризованим середовищем і стрептоміцином. Результати підрахунку кількості життєздатних клітин у культурах вносять у табл. 6.2.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: