Приготовление инокулюма из бульонной культуры

При определении чувствительности быстро рас­тущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35° С. Через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии при­близительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физраствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо при­обретен, либо приготовлен в лаборатории.

Метод серийных разведений. Методом серийных разведений МИК определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроба в пробирках или чашках с пи­тательной средой, содержащих убывающие концентрации анти­биотика. Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcus aureus, выделенной от больного, в ряду пробирок готовят двукратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне, для чего содержимое пробирки перемешивается и переносится 1 мл из 2-я
пробирки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю и т.д., а из последней пробирки
1 мл удаляется.

Таблица 1

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (МИК, мкг/мл) методом серийных разведений в бульоне

Учетным признаком при этом является наличие/отсутствие мут­ности бульона в пробирках. В контроле культуры должна быть мутность, в остальных контролях - нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен). Так, если бульон будет мутным в 4-й и 5-й опытных пробирках, МИК тетрациклина = 16 мкг/мл Известно, что величина К тетрациклина при введении среднетерапевтических доз — 2 мкг/мл (при использовании максимальных доз — 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = 16/2 = 8 (> 0,3), т.е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не даст антимикробного эффекта в отношении Staphylococcus aureus у данного больного даже при введении максимальных доз (Т = 16/10 =1,6 Метод серийных разведений считается наиболее точным, но относительно трудоемким.

Диско-диффузионный метод (ДДМ)

Принцип метода. ДДМ определения чувствиельности основан на способности АБП диффунди­ровать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара.

Питательная среда. Для определения чувстви­тельности ДДМ используют такую же, как и для метода разведений в агаре, питательную среду. К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода выдвигаются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки метода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы контроля качества.

Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой связано с некоторыми особенностя­ми. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Важным моментом при определении чувствительности ДДМ явля­ется толщина слоя агара в чашке. Она должна составлять 4,0+0,5 мм, что достигается при внесении в чашку Петри диаметром 90 мм строго 20 мл агара, диаметром 100 мм - 25 мл агара, а диаметром 150 мм - 60 мл агара. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Соблюдение указанных предосторожностей необходимо в связи с тем, что размер и форма зоны подавления роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Хранить чашки можно запаянными в полиэтиленовые пакеты при 4-8 °С в течение 7-10 сут. При использовании свежеприготовленных чашек или чашек после хра­нения в холодильнике их необходимо подсушить перед инокуляцией, что достигается инкубацией при 35 °С с приоткрытой крышкой в течение 10-20 мин. Перед инокуляцией необходимо проконтроли­ровать отсутствие конденсата жидкости на внут­ренней поверхности крышек.

Диски с антибиотиками. Для определения чувствительности ДДМ следует использовать только стандартизированные качественные диски. Изго­товление дисков с АБП, необходимых для опреде­ления чувствительности диско-диффузионным ме­тодом, в лабораторных условиях нецелесообразно. Это связано с жесткими требованиями к исходным материалам (субстанциям АБП, картону) и со зна­чительной трудоемкостью методов контроля каче­ства дисков.

Для получения правильных результатов опреде­ления чувствительности ДДМ необходимо строго соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может снизиться ниже допус­тимого уровня (прежде всего в результате увлажне­ния) еще до истечения срока годности.

Долговременное хранение дисков с АБП осуще­ствляется в герметичной упаковке в морозильной камере при температуре -18 °С и ниже. Небольшие партии дисков, используемые в повседневной рабо­те, можно хранить в холодильнике при температуре 4-8 °С, плотно укупоренными так, чтобы гаранти­ровать невозможность попадания во флакон влаги, кроме того, для дополнительной защиты от влаги во флаконах (картриджах) с дисками коммерческого изготовления содержится специальный влагопоглотитель (силикагель).

Флаконы (картриджи) с дисками следует извле­кать из холодильника за 1 ч до начала работы и вы­держивать герметично закрытыми до достижения ими комнатной температуры, что предотвращает образование конденсата на дисках после открыва­ния флаконов.

Стан­дартный инокулюм наносят пипеткой на поверх­ность чашки Петри с питательной средой в объеме 1-2 мл, равномерно распределяют по поверхности покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсуши­вают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Аппликация дисков и инкубация. Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с АБП. Апплика­цию дисков проводят с помощью стерильного пин­цета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диа­метром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с АБП. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 35 °С в течение 18-24 ч (в зависимости от вида тестируемого мик­роорганизма). Увеличение интервала времени меж­ду нанесением дисков на поверхность среды и нача­лом инкубации (а соответственно - началом роста исследуемой культуры микроорганизма) приводит к «преддиффузии» АБП в агар и к увеличению ди­аметра зоны подавления роста.

Учет результатов. После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон за­держки роста измеряют с точностью до 1 мм, пред­почтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем (Таблица 2).

При измерении зон задержки роста следует ори­ентироваться на зону полного подавления видимо­го роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны за­держки роста только при особых условиях освеще­ния или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Исключение составляют случаи учета резуль­татов определения чувствительности стафилокок­ков к оксациллину, когда необходимо учитывать и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста.

Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом случае необходимо повторить идентификацию ми­кроорганизма, формирующего эту колонию, и опре­деление чувствительности этого штамма.

При определении чувствительности ДДМ роя­щихся штаммов протея, зона подавления роста мо­жет быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая не мешает установлению границы зоны и не учитывается при регистрации результатов.

При определении чувствительности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом гра­ницу зоны подавления роста следует учитывать на уровне подавления роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полным подавлением роста возможно завершение 1-2 цик­лов пролиферации микроорганизма Другие методы. Промежуточное положение между двумя вышеописанными методами занимает метод определения чувствительности с помощью Е-тестов. Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4,…., мкг/мл). Е-тесты, как и диски при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде «газона». После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста, которая сужается в области малых концентраций и «пересекает» полоску на уровне, соответствующем величине МИК (рисунок 1).

При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам. Это по­зволяет упростить и ускорить проведение исследования, а также снизить его стоимость. Наиболее часто применяют методы серий­ных разведений в планшетах и пограничных концентраций (микро­методы). В первом случае, как правило, используют готовые сте­рильные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки кото­рых внесены и лиофильно высушены убывающие концентрации антибиотиков в бульоне. После вскрытия планшета стандартизо­ванную суспензию испытуемой культуры в одинаковой дозе (на­пример, 0,1 мл) асептически вносят в соответствующие ряды лу­нок, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной темпе­ратуре. Среда при этом восстанавливается, что позволяет после инкубирования планшета отметить рост (помутнение бульона) в тех лунках, где антибиотик не дей­ствует (Рисунок 2) При помутнении бульона в контроле куль­туры и опытных лунках определяют величину МИК. Учет можно вести как визуально, так и с помощью специ­альных микробиологических анализа­торов. В этих приборах имеется воз­можность автоматизации основных действий: внесения культуры, инку­бирования, встряхивания, определе­ния оптической плотности (степени мутности) жидкости в каждой лун­ке, графическое отображение результатов (в том числе в динамике), определение степени чувствительности и печать протокола исследования.

Метод пограничных концентраций можно считать усеченным методом серийных разведений. В соответствии с ним испытуемую культуру вносят только в две лунки (пробирки), где находятся высокая (С) и низкая (с) концентрации антибиотика. Концентрация С соответствует границе между устойчивыми и умеренно устойчивыми штаммами, а концентрация с — границе между умеренно устойчивыми и чувствительными штаммами. Если после инкубирования рост отсутствует в обеих лунках, штамм относят к чувствительным, если только в лунке с концентрацией С - к умеренно устойчивыми штаммам, а если в обеих лунках имеется рост, штамм относят к устойчивым.

Важными условиями корректного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам являются:

Ø использование только чистых культур и соблюдение правил асептики;

Ø применение стандартных питательных сред, соответствующих
питательным потребностям испытуемого микроорганизма (среда)
Мюллера — Хинтона, агар АГВ, среда НТМ и др.);

Ø внесение испытуемой культуры в стандартной дозе и соблюдение установленного соотношения инокулюм/среда;

Ø правильный режим инкубирования и метод учета.

Учитывая то, что признак подвержен фенотипическим и генотипическим изменениям, чувствительность к антибиотикам желательно проверять у свежевыделенных культур, выделенных из материала до начала антибиотикотерапии, и повторять исследование с культурами, выделенными в ходе лечения.

В последние годы в практике стали применять ПЦР для выявления у микробов специфических генов, ответственных за фор­мирование лекарственной устойчивости (геноиндикация антибиотикоустойчивых культур).

Задание:

Определить чувствительность культур E. coli и S. aureus диско-диффузионным методом.

Методика:

Ø Отобрать несколь­ко однотипных изолированных колоний, петлей пе­ренести незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной пита­тельной среды. Инкубировать при 35° С. Через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии при­близительно соответствует необходимой, и ее точно довести до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физраствора.

Ø Стан­дартный инокулюм нанести пипеткой на поверх­ность чашки Петри с питательной средой в объеме 1-2 мл, равномерно распределяя по поверхности покачиванием, после чего удалить избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсуши­ть при комнатной температуре в течение 10-15 мин

Ø Через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды нанести диски с АБП. Апплика­цию дисков проводят с помощью стерильного пин­цета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диа­метром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с АБП

Ø Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри поместить в термостат кверху дном и инкубировать при температуре 35 °С в течение 18-24 ч

Ø Учесть результаты, измерив зоны задержки роста линейкой и определить устойчивость, пользуясь таблицей 2

Ø Результаты и ход исследования занести в тетрадь

СКР

1. Дайте определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика.

2. Что такое терапевтический индекс?

3. Какой из методов определения чувствительности к антибиотикам наиболее точный?

4. Что такое Е-тесты?

ЛИТЕРАТУРА

Основная

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство, 2005 г.

1. Медицинская микробиология. Гл. редакторы акад. РАМН В.И. Покровский, проф. О.К. Поздеев М.: ГЭОТАР Медицина, 1999 г.
2. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. Под редакцией академика РАМН А.А.Воробьева. Москва,2008. – 704 с.

Дополнительная

1. Медицинская микробиология. Учебное пособие Под редакцией А. М. Королюка и В. Б. Сбойчакова. Санкт_Петербург, ЭЛБИ-Спб, 2002 г.

2. Павлович С.А. Основы вирусологии. Минск, Вышэйшая школа, 2001 г.

3. Медицинская микробиология Алешукина А.В.

СОДЕРЖАНИЕ

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: