ТОР 5 статей: Методические подходы к анализу финансового состояния предприятия Проблема периодизации русской литературы ХХ века. Краткая характеристика второй половины ХХ века Характеристика шлифовальных кругов и ее маркировка Служебные части речи. Предлог. Союз. Частицы КАТЕГОРИИ:
|
ТРАНСФОРМАЦИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХЛОРИСТОГО КАЛЬЦИЯЭтот способ трансформации бактерий плазмидной ДНК применяется наиболее часто (Mandel, Hida, 1970). Выход трансформантов составляет 105-107 на 1 мкг интактной ДНК рВR322 при использования штамма Е. coli НВ101. 1. Внесите в 500-мл колбу 100 мл бульона L и 1 мл ночной Примечание. Соотношение между оптической плотностью и числом жизнеспособных бактерий в 1 млкультуры варьирует от штамма к штамму. Например, для штаммов r ес+( c1776, ММ284) концентрации 5·107 клетка/мл соответствует D 550 = = 0,2, а для штаммов rec- (DH1, НВ101) концентрации 5·107 клетка/мл соответствует D550 = 0,5. Калибровочную кривую зависимости d550 от числа бактерий в 1 мл культуры следует строить для каждого нового штамма Е. соli, применяемого в работе. 2. Охладите культуру во льду (10 мин). Отцентрифугируй- 3. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клет- 4. Поместите суспензию клеток в ледяную баню на 15 мин, 5. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клет- Примечание. Для максимальной эффективности трансформации очень важно, 1) чтобы бактерии находились в логарифмической фазе роста и чтобы во время обработки хлористым кальцием плотность суспензии была низкой; 2) чтобы клетки выдерживались при 4°С 12—24 ч. За это время эффективность трансформации возрастает в 4—6 раз (Dagert, Ehrlich, 1979). Через 48 ч она снизится до первоначального уровня. 6. Добавьте ДНК в буфере, применяемом для реакции с ли- 7. Перенесите пробы в водяную баню (42°С) на 2 мин 8. Добавьте в каждую пробирку по 1,0 мл бульона L и ин- 9. Высейте удобное количество клеток на плотную селектив- Если селекцию ведут на устойчивость к тетрациклину, то трансформационную смесь можно целиком высеять в одну чашку. При селекции на устойчивость к ампициллину в чашку следует высевать только часть культуры (найденную эмпирически), так как число вырастающих трансформантов увеличивается не пропорционально высеваемому объему, возможно, из-за накопления в среде токсичных веществ, выделяемых убитыми антибиотиком клетками. Кроме того, при селекции на устойчивость к ампициллину плотность высеваемой суспензии должна быть низкой, а чашки нужно перенести через 16—24 ч; из термостата в холодильник (4°С). Дело в том, что ампициллин разрушается b-лактамазой, секретируемой устойчивыми трансформантами, поэтому при густом засеве или длительной инкубации вокруг колоний трансформантов вырастут сателлитные колонии, сформированные чувствительными к антибиотику клетками. 10. Оставьте чашки при комнатной температуре, пока не затвердеет верхний агар или не впитается жидкость. 11. Переверните чашки и инкубируйте их при 37 оС. Колонии должны появиться через 12—16 ч.
Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:
|