Лабораторная работа № 2. Качественные реакции на аминокислоты и белки

Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам. Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция. Примерами реакции второго типа являются многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот. Многие из них весьма чувствительны и высокоспецифичны, что позволяет обнаружить ничтожные количества той или иной аминокислоты в составе сложных смесей, в биологических жидкостях, гидролизатах белков.

Материалы, реактивы, оборудование. Свежее яйцо, 10%-ный и 30%-ный раствор едкого натра, 1%-ный раствор сернокислой меди, 1%-ный раствор нингидрина в 95%-ном ацетоне, 2%-ный спиртовой раствор a-нафтола, гипобромит натрия, реактив Миллона, ледяная уксусная кислота, концентрированные серная, соляная и азотные кислоты, глиоксиловая кислота, 2,5%-ный раствор формальдегида, 0,5%-ный и 0,05%-ный раствор нитрита натрия, 1%-ный раствор сульфаниловой кислоты в 5% растворе соляной кислоты, 10%-ный раствор соды, раствор нитропруссида натрия, концентрированный раствор аммиака, уксуснокислый свинец, сода сухая, насыщенный раствор пикриновой кислоты.

Ход работы.

1) Биуретовая реакция. К 1-2 мл разбавленного белка (см. предыдущую работу) прибавляют двойной объем 30%-ного раствора едкого натра, хорошо перемешивают и добавляют из капельницы или при помощи пипетки 2-3 капли 1%-ного раствора медного купороса. Снова тщательно перемешивают. Развивается красно-фиолетовое окрашивание. Для сравнения проводят эту же реакцию с биуретом, который легко может быть получен нагреванием мочевины. Для этого несколько кристаллов мочевины помещают в пробирку и осторожно прокаливают в пламени горелки. Пробирку охлаждают, приливают 10% раствор едкого натра и несколько капель 1% раствора медного купороса. После перемешивания развивается красно-фиолетовое окрашивание, характерное для образующегося внутрикомплексного соединения:

2) Нингидриновая реакция (на свободную аминогруппу аминокислот). К 2-3 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

3) Реакция Адамкевича. Наливают в пробирку несколько капель неразбавленного белка, прибавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты и несильно нагревают до растворения образующегося остатка. Охлаждают пробирку со смесью, а затем, сильно наклонив ее, осторожно, по стенке приливают 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы обе жидкости не смешались. При стоянии на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовое кольцо. Окраска возникает за счет реакции триптофана с глиоксиловой кислотой, всегда присутствующей в уксусной кислоте в виде примеси. Поэтому для усиления реакции вместе с уксусной кислотой можно добавлять немного глиоксиловой кислоты, которую получают восстановлением щавелевой кислоты.

4) Ксантопротеиновая реакция. К 1 мл раствора белка добавляют 5—6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося под влиянием кислоты белка. При нагревании раствор и осадок окрашивается в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется.

Смесь охлаждают и к кислой жидкости и осторожно, по каплям, не взбалтывая, добавляют избыток концентрированного гидрата окиси аммония или едкой щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумина растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Ксантопротеиновая реакция зависит от наличия в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). Эти аминокислоты в результате нитрования образуют желтоокрашенные нитросоединения. Переход желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлен изменением структуры щелочных солей этих нитросоединений. Желатина, не содержащая ароматических аминокислот, не дает этой реакции.

5) Нитропруссидная реакция. В пробирку берут 3 мл разбавленного раствора белка, приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и 2-3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями крепкого раствора аммиака.

Если в белке есть аминокислота цистеин, то осуществляется реакция, в результате которой развивается пурпурное окрашивание.

6) Реакция на «слабосвязанную серу». В пробирку наливают 0,5-1,0 мл неразбавленного белка, добавляют двойной объем концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников и кипятят смесь (осторожно, жидкость может выбросить!). При этом выделяется аммиак, который может быть обнаружен по запаху и по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки!). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипячении.

Горячую щелочную жидкость делят на 2 части: к первой приливают раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор едкой щелочи по каплям до растворения образующегося вначале осадка гидрата окиси свинца.)

В другую пробирку прибавляют 2-3 капли свежеприготовленного разбавленного раствора нитропруссида натрия — получается красно-фиолетовое окрашивание.

Под действием едких щелочей белки подвергаются частичному гидролизу по пептидным связям, превращаясь в щелочные альбуминаты. Наряду с этим наблюдается отщепление части аминогрупп в виде аммиака. При наличии в молекуле белка аминокислот, содержащих серу (цистина, цистеина), от этих аминокислот постепенно отщепляется также и сера в виде двухвалентного иона. Его образование обнаруживают с помощью ионов различных металлов, особенно ионов свинца, образующих с S черный нерастворимый сернистый свинец:

Рb (NО_з)₂ +2NаОН—>Рb (ОН)₂ +2NаNО_з

Рb (ОН)₂ +2NaОН —>Na₂РЬO₂ +2Н₂0

Nа₂РЬO₂ +Н₂S—> РbS +2NаОН

Ион серы, образующийся из сероводорода в резко щелочной среде, может быть открыт нитропруссидом натрия, являющимся реактивом на ион S.

7) Реакция Сакагучи. Берут в пробирку 2-3 мл разбавленного раствора белка, добавляют 1 мл 10%-ного раствора едкого натра и вслед за этим несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора a- нафтола. Перемешивают и приливают 0,5 мл раствора гипобромита натрия и вновь перемешивают. Развивается оранжево- красное окрашивание.

Появление окраски объясняется взаимодействием a-нафтола в присутствии окислителя с гуанидиловыми группировками радикалов аргинина, имеющихся в молекуле белка.

8) Реакция Миллона. К 0,5-1 мл неразбавленного белка прибавляют двойной объем азотнортутного реактива Миллона. Белок свертывается под действием солей ртути и азотной кислоты, входящих в реактив, образуя сгусток белого цвета. При нагревании пробирки в пламени горелки осадок окрашивается в кирпично-красный цвет.

Реакцию Миллона дают все белки, содержащие в своем составе остаток тирозина.

9) Реакция Вуазене. К 2 мл разбавленного раствора белка в пробирке добавляют 1 каплю 2,5%-ного раствора формальдегида. Смешивают и прибавляют 6 мл чистой концентрированной соляной кислоты удельного веса не менее 1,175, после чего снова перемешивают. Через 10 минут прибавляют при взбалтывании 10 капель 0,05%-ного раствора нитрита натрия. Развивается интенсивное окрашивание.

Реакция Вуазене также протекает с теми белками, которые содержат в своем составе триптофан.

10) Реакция Паули. К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты приливают 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора соды. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание.

Возникновение окраски обусловлено присутствием в белковой молекуле гистидина и тирозина.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: