Радиальная хроматография.

Исходные растворы наносят вблизи центра бумажного диска, зажатого по краям. Смесь растворителей подводят к центру диска при помощи «ножек» из бумаги.

Проводят разделение смеси, состоящей из трех аминокислот: аланина, глутаминовой кислоты и лейцина.

Ход работы. 1. Нанесение раствора на хроматографическую бумагу. Вырезают из хроматографической бумаги диск диаметром 14 см. Диск перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг другу и от центра делают четыре надреза в 2 см по линиям сгиба; полученные в виде белков «ножки» отгибают. На расстоянии 1 см от линии сгиба «ножек» простым карандашом проводят линии, на середине которых отмечают точки, соответственно их обозначая. В эти точки при помощи стеклянных капилляров наносят небольшое количество исследуемых растворов. В одну точку наносят исследуемую смесь аминокислот, в три другие – растворы аминокислот – «свидетелей», входящих в смесь – аланина, глутаминовой кислоты, лейцина. На одну и туже точку следует наносить по 2-3 капли раствора, при этом после нанесения каждой капли бумагу слегка просушивают на воздухе и лишь затем наносят следующую каплю.

2. Помещение хроматограммы в хроматографическую камеру. Просушенную на воздухе хроматограмму помещают между двумя половинами чашек Петри с одинаковыми диаметрами, образующими хроматографическую камеру, так чтобы «ножки» хроматограммы были погружены в 80% водонасыщенный фенол, который наливают в нижнюю чашку. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре в течение 30-40 мин.

Насыщенный водой фенол впитывается бумажным диском и движется по нему, увлекая нанесенные вещества. Дальнейшее продвижение растворителя вызывает разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью соответственно коэффициентам их распределения между водой и фенолом.

3. Проявление хроматограммы. По истечении 30-40 мин, когда фронт растворителя пройдет путь около 4,5 см, хроматограмму извлекают из камеры, сушат в течение 10 мин в сушильном шкафу при температуре 60-80˚С для удаления фенола. После этого хроматограмму проявляют, опрыскивая ее из пульверизатора 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, дающим цветную реакцию с α – аминокислотами, и помещают в сушильный шкаф на 5 мин при температуре 80˚С. На хроматограмме появляются пятна сине-фиолетового цвета, каждое пятно соответствует отдельной аминокислоте. Сопоставляя положения пятен «свидетелей», определяют наличие тех или иных аминокислот в исследуемой смеси.

Задание: устно рассказать о хроматографических методах исследования.

Занятие 9 - Электрофорез – как метод анализа белков

Электрофорез – явление, характеризующееся направленным движением молекул белка в электрическом поле к одному из полюсов. Также как при хроматографии, исследуемое вещество помещают на твердый носитель, в качестве которого используют бумагу, агар-агар, полиактриламидный гель и т.д.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: