Хроматографический метод определения аминокислот

В настоящее время для разделения и количественного определения белков и аминокислот, а также нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и их метаболитов широко используется метод хроматографии – динамического разделения смеси веществ.

Существует несколько разновидностей хроматографического метода анализа, различающихся по механизму разделения веществ. Важнейшими из них являются следующие:

адсорбционная хроматография, основанная на различной способности отдельных соединений адсорбироваться на тех или иных сорбентах;

ионообменная хроматография, основанная на различной способности разделяемых веществ к ионному обмену с тем или иным ионитом;

распределительная хроматография, основанная на различной растворимости разделяемых веществ в двух частично смешивающихся жидкостях;

диффузионная хроматография, основанная на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента; к этому типу хроматографии относится гель-фильтрационная хроматография, разделение веществ при которой основано на механическом явлении молекулярного просеивания;

хроматография по сродству, новый и высокоспецифический метод разделения различных соединений, основанный на применении нерастворимых биологически активных веществ, обладающих сродством к разделяемым веществам.

Различаются хроматографические методы анализа и по технике выполнения. Так адсорбционная, ионообменная, распределительная и диффузионная хроматографии могут проводиться в колонках и на плоскости (на бумаге или в тонких слоях).

При газовой хроматографии (адсорбционной или распределительной) разделение смеси веществ ведется в атмосфере газа (разделение компонентов газовой смеси).

Современные хроматографические методы позволяют быстро выделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси.

Для разделения аминокислот наиболее доступным и сравнительно точным является метод распределительной хроматографии на бумаге. Для этой цели можно применять любую фильтровальную бумагу хорошего качества. Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.). Водная фаза неподвижна, так как в данном случае вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (в хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной фазой обычно является насыщенный водой раствор фенола. Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше – в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем.

Сущность метода заключается в том, что на хроматографическую бумагу в одну точку или по одной линии наносят исследуемую смесь веществ (аминокислот). После подсушивания конец бумаги погружают в смесь растворителей, которая вследствие капиллярности бумаги постепенно всасывается в нее. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые растворяются в нем хуже, делают более короткий путь. Когда фронт растворителя начнет приближаться к другому краю бумаги, процесс прекращают и бумагу высушивают. Затем хроматограмму проявляют реагентом, дающим с аминокислотами цветную реакцию. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

Скорость перемещения отдельных аминокислот может быть выражена посредством коэффициента распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (в составе исследуемой смеси) до середины ее пятна (a) к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (b):

R_f = а/в

Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).

Наиболее часто идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму. Методы хроматографического анализа на бумаге довольно разнообразны.

1. Хроматографическое разделение растительных пигментов на бумаге

Приборы. Ступка фарфоровмя, химический стакан на 250 мл., стеклянная палочка, полосы фильтровальной бумаги 4х25 мм, штатив с кольцом, воронка с бумажным фильтром.

Реактивы. Стеклянный песок, свежие зеленые листья, ацетон, 85% раствор, мел.

Ход работы. Берут 2,0 г мелкоизмельченных листьев, помещают их в фарфоровую ступку и добавляют небольшое количество стеклянного песка и щепотку мела (для нейтрализации органических кислот, находящихся в растительных соках). К полученной смеси небольшими порциями добавляют 10 мл ацетона, непрерывно растирая содержимое ступки. Когда в ступке образуется однородная масса, ее фильтруют через бумажный фильтр в химический стакан. В отфильтрованный ацетоновый экстракт из листьев опскают на 2-3 мм полоску фильтровальной бумаги, укрепленную при помощи скрепки на стеклянной палочке. Полоска бумаги не должна касаться стенок стакана. Спустя 20-30 мин наблюдают зональное разделение разноокрашенных растительных пигментов на полоске фильтровальной бумаги.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: