Материалы и методы исследований

В качестве объекта исследований использовались полученные нами ранее моноклональные антитела (МКА) к полипептидному антигену р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота, продуцируемые штаммом гибридных клеток Mus musculus Mab/2F9-p24.

В опыте были использованы следующие животные:

- мыши линии BALB/c 7-8 недельного возраста в количестве 15 голов.

Материалами исследования послужили: 96-луночные полистироловые планшеты, буферные растворы (1^×PBS, PBS-Tw, физиологический раствор), блокирующие реагенты (5% раствор молока, 1% BSA, 0,1% желатин), субстраты (TMB, ОФД), антигены ВЛКРС gp-51 и p-24, МКА (2F9B11), антивидовые конъюгаты (Anti bovine IgG), стоп-реагент (2М H₂SO₄), Н₂О₂, 70% этиловый спирт.

При постановке серологических реакций использовались буферные системы, растворы которых готовили по следующим прописям:

1 Приготовление PBS-Tw

Материалы: Дистиллированная вода, 10×PBS, Tween-20

Метод: К 1350 мл дистиллированной воды добавляем 150 мл 10×PBS и 750 мкл Tween-20.

2 Приготовление 1^×PBS

Материалы: Дистиллированная вода, 10^×PBS

Метод: К 900 мл дистиллированной воды добавляем 100 мл 10^×PBS.

3 Приготовление физиологического раствора

Материалы: NaCl, дистиллированная вода

Метод: К 100 мл дистиллированной воды добавляем 0,9 г NaCl.

4Приготовление 5% раствора молока

Материалы: Сухое обезжиренное молоко, 1^×PBS

Метод: К 10 мл 1^×PBS добавляем 0,5 г сухого обезжиренного молока.

5 Приготовление 1% раствора BSA

Материалы: BSA, 1^×PBS

Метод: К 5 мл 1^×PBS добавляем 0,05 г BSA.

6 Приготовление раствора желатина

Материалы: Желатин, 1^×PBS

Метод: К 10 мл 1^×PBS добавляем 10 г желатина.

Для иммунизации мышей использовали препараты, полученные путем конъюгирования специфических МКА с носителем, в качестве которого использовались коллоидное золото и бычий сывороточный альбумин (БСА).

Определение концентрации белка по М. Бредфорд

Раствор готовили следующим образом: 100 мг Кумасси растворяли в 59 мл этанола, добавляли 100 мл 85% Н₃РО₄, остужали, доводили до 1 литра дистиллированной водой. В лунки первого ряда вносили по 0,1 мл пробы белка неизвестной концентрации и бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 1 мг/мл в качестве контроля. В лунки следующих рядов вносили по 0,05 мл ЗФР (рН 7,2-7,4). Опытные и контрольные пробы белка раститровывали в объеме 50 мкл. В каждую лунку вносили по 0,05 мл реактива Бредфорда и учитывали результат на спектрофотометре при длине волны 492нм [38].

Гибридомная техника

Приготовление культуральной среды

Для культивирования клеточных культур использовали среду RPMI-1640 («Sigma», США). Для приготовления 1 литра неполной культуральной среды к 863 мл деионизированной воды добавляли следующие компоненты: 100 мл 10-кратного концентрата RPMI-1640; 10 мл 100 мм пирувата натрия («Sigma», США); 26,7 мл 7,5% бикарбоната натрия; 2,283 г Hepes («Sigma», США); 0,3 г L -глютамина («Sigma», США); 0,003 мл 2-меркаптоэтанола (Laboratory building «A», Россия). рН среды доводили до 7,2-7,4 с помощью NaOH и стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры 0,22 мкм («Millipore», США). Полученную ростовую среду для культивирования гибридных клеток готовили добавлением в неполную ростовую среду 10% к объему среды стерильной сыворотки плода коровы («HyKlon», США), инактивированной нагреванием при 56^оС в течение 30 минут.

Иммунизация мышей

Мышам в первый день иммунизации вводили внутрибрюшинно по 0,1 мг антигена с 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда («Sigma», США), на 7 день - 0,1 мг антигена с 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецировали по 0,1 мг антигена в забуференном физиологическом растворе, рН 7,2-7,4 [39].

Подготовка иммунных спленоцитов

Спустя четыре дня после последней инъекции по схеме иммунизации убивали животных с наиболее высокими титрами антител в иммуноферментном анализе (не менее 1:800) методом цервикальной дислокации. Покровы кожи обрабатывали 70% этиловым спиртом. В стерильных условиях извлекали селезенку и помещали ее в чашку Петри. В шприц набирали неполную ростовую среду в объеме не менее 10 мл, и вымывали из селезенки спленоциты путем перфузии. Суспензию клеток переносили в стерильную пробирку с коническим дном и центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин. Осадок суспендировали в 5 мл неполной ростовой среды и подсчитывали количество клеток в камере Горяева.

Подготовка миеломных клеток

Для гибридизации использовали миеломную линию клеток Р3Х63Ag8.653, замороженных в специальных пластиковых ампулах с завинчивающими крышками («Sarstedt», Германия). Перед слиянием замороженные ампулы с клетками из жидкого азота переносили в водяную баню на 37°С. Содержимое ампулы переносили в центрифужную пробирку с 10 мл холодной неполной ростовой среды и перемешивали. Центрифугировали 5-7 минут при 1000 об/мин. Супернатант сливали, к осадку клеток добавляли необходимый объем полной ростовой среды, суспендировали и переносили в ячейки 24-луночного планшета на слой «питающих клеток» в количестве 200-300 клеток в каждую ячейку. Инкубировали клетки при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Для гибридизации использовали клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Клетки переносили из культуральных сосудов в центрифужные пробирки (прикрепившиеся к подложке клетки снимали мягким пипетированием) и центрифугировали 5-7 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок суспендировали в 5 мл неполной ростовой среды и подсчитывали количество клеток в камере Горяева.

Приготовление культуры перитонеальных макрофагов

За 2-3 дня до слияния клеток, в стерильных условиях выделяли перитонеальные макрофаги беспородных мышей и высевали их в ячейки четырех 96-луночных планшет. Для этого мышь забивали методом цервикальной дислокации. Для дезинфекции кожного покрова ее обрабатывали 70% спиртом. После этого препарировали кожу, разрезая ее по белой линии живота. С помощью шприца вводили 10 мл охлажденной неполной ростовой среды. Иглу вводили через тазобедренные мышцы во избежание обратного оттока жидкости из брюшной полости. После введения среды вызывали раздражение брюшной стенки нанесением легких ударов пинцетом в течение 5 минут. Затем отбирали суспензию перитонеальных макрофагов из брюшной полости и осаждали их центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Осадок клеток ресуспендировали в полной ростовой среде из расчета 2×10⁵ клеток в 1 мл и высевали в ячейки 96-луночного планшета. Клетки выращивали в СО₂ -инкубаторе («Bindek», Германия) при температуре 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

Приготовление раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ)

ПЭГ («Fluka», Швейцария) с молекулярной массой 4000 расплавляли на водяной бане до жидкого состояния. Затем к 1,5 мл неполной культуральной среды RPMI-1640 добавляли 1,5 мл расплавленного ПЭГ и 0,3 мл диметилсульфооксида (ДМСО) («MPBiomedials», Франция), рН раствора готовили до 8,0-8,5 с помощью концентрированного едкого натрия. Приготовленный таким образом раствор ПЭГ стерилизовали фильтрованием через фильтры с размером пор 0,22 мкм («Millipore», США). Для проверки стерильности приготовленный ПЭГ инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Непосредственно перед гибридизацией раствор ПЭГ нагревали до 37°С.

Гибридизация клеток (слияние)

Гибридизацию клеток миеломы и иммунных спленоцитов проводили по методу V. Oi, L. Herzenberg [40].

Гибридизацию клеток проводили в стерильных условиях в ламинарных шкафах («TelStar», Испания). Иммунизированную мышь обездвиживали методом цервикальной дислокации. После обездвиживания проводили обработку кожного покрова 70% спиртом. Затем, не нарушая целостности стенок брюшной полости, препарировали кожу. В области расположения селезенки делали разрез на брюшной стенке, не нарушая целостности капсулы извлекали селезенку, и отмывали ее три раза в неполной ростовой среде. Селезенку помещали в чашку Петри и вымывали из нее спленоциты (лимфоциты) неполной ростовой средой путем перфузии. Суспензию полученных спленоцитов центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Осадок клеток ресуспендировали в неполной ростовой среде, подсчет клеток проводили в камере Горяева, подсчитывали их количество. Необходимое количество лимфоцитов использовали для гибридизации, а остальные замораживали в жидком азоте.

Клетки миеломной линии Р3Х63Ag8.653, находящиеся в логарифмической фазе роста, и спленоциты смешивали в соотношении 1:5 (1 млн. клеток миеломной линии и 5 млн. клеток лимфоцитов). Центрифугировали 7-10 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок осторожно встряхивали и добавляли к нему в течение 1 минуты 1 мл теплого (37°С) раствора ПЭГ-4000, осторожно перемешивая. Медленно приливали 9 мл неполной ростовой среды и тщательно перемешивали. Смесь выдерживали 10 мин при температуре 37°С и центрифугировали 7-10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок суспендировали в 40 мл полной ростовой среды и высевали в ячейки 96-луночного планшета с «питающим слоем» перитонеальных клеток, приготовленных за 2 дня до гибридизации. Суспензию клеток в полной ростовой среде разливали по 100 мкл в каждую ячейку планшета с помощью многоканальной микропипетки («Ленпипет», Россия). Планшеты с клетками инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

Через 24 часа после посева гибридизированных клеток в каждую ячейку планшета добавляли равное количество среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ) («Sigma», США) в двукратной концентрации. При этом объем селективной ростовой среды в каждой ячейке увеличивался до 0,2 мл, а концентрация ГАТ уменьшалась в 2 раза и становилась однократной.

Отбор клонов гибридных клеток – продуцентов моноклональных антител

Рост клонов гибридом в лунках планшеты учитывали, начиная с 7-10 суток после слияния. Просматривали лунки при помощи инвертированного микроскопа и отмечали в них наличие гибридных клонов. Гибридные клетки представляли собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Из лунок, в которых отмечен рост единичных клонов, отбирали образцы культуральной среды в объеме 0,1 мл и исследовали их на содержание антител в иммуноферментном анализе.

Иммуноферментный анализ проводили по следующей схеме: МКА, использованные для получения конъюгированных препаратов и иммунизации мышей, адсорбировали в ячейках планшета для иммунологических реакций в объеме 0,1 мл, выдерживая в течение ночи при 4°С. Затем ячейки планшета отмывали 3 раза ЗФР с 0,05% содержанием твин-20 и 3 раза ЗФР. Блокировали свободные участки носителя путем внесения в каждую из них 0,1 мл 5% раствора обезжиренного сухого молока и инкубировали планшет 1 час при температуре 37°С. Планшет отмывали, как описано выше. Затем в ячейки вносили образцы ростовой среды гибридных клеток и выдерживали 1 час при 37°С. Ячейки вновь отмывали, а затем вносили раствор специфического конъюгата полученного путем сшивки МКА с ферментов пероксидазой хрена и инкубировали 1 час при 37°С. Результаты ИФА определяли после отмывки ячеек планшета и добавления в них субстрата фермента – тиаминобензидина (ТМБ). Через 10 минут останавливали реакцию внесением в ячейки 0,1 мл 0,5М серной кислоты. Результаты ИФА оценивали визуально или количественно с помощью фотометра «Expert» (Австрия) при длине волны 450 нм. Положительная реакция характеризовалась окрашиванием жидкости (раствора субстрата) в синий цвет различной интенсивности. В лунки, из которых была отобрана культуральная среда, добавляли равное количество полной ростовой среды, содержащей гипоксантин и тимидин (ГТ).

В последующих исследованиях гибридом на продукцию антител в лунки планшеты добавляли полную ростовую среду. Если находили культуру, продуцирующую специфические антитела, то клетки ресуспендировали и переносили в лунку 24-луночного планшета. Если культура продолжала продуцировать специфические антитела при выращивании на 24-луночных планшетах, клетки размножали последовательным переносом в матрацы и подвергали клонированию. После получения достаточного количества клетки замораживали.

Замораживание ﴾ криоконсервирование), размораживание гибридом

Криоконсервировали гибридные клетки, растущие на 24-луночных планшетах или матрацах объемом 25 см³. При отборе гибридом для замораживания выбирали ячейки с жизнеспособными клетками при плотности не менее 70-80%.

Клетки для криоконсервации готовили следующим образом. За 24 часа до криоконсервации меняли питательную среду в каждом матраце или в ячейках 24-луночного планшета. Снимали клетки с поверхности посуды мягким пипетированием, отбирали взвесь клеток и переносили в пробирку с коническим дном. Взвесь центрифугировали 7 минут при 1000 об/мин. К осадку добавляли криопротектор – сыворотку плода коровы («HyKlon», США) с 10% диметилсульфоксидом ﴾ДМСО﴿. Осадок клеток суспендировали пипетированием и разливали в ампулы («Nunc», Дания) в объеме 1 мл по 1-5 тыс. кл/мл. Ампулы помещали в пенопластовые коробки с толщиной стенок 2 см и ставили в низкотемпературный холодильник ﴾-70°С﴿ на сутки, после чего их переносили в жидкий азот.

При размораживании криоконсервированных гибридных клеток ампулы с клетками из жидкого азота переносили в водяную баню на 37°С. Как только растаяли последние кусочки льда, суспензию клеток переносили в стерильную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывали один раз путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 7 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали в полной ростовой среде и засевали в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Клетки гибридом культивировали в СО₂ -инкубаторе при 37°С в течение 2-3-суток [41].

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: