Иммунизация линейных мышей с целью выработки специфического ответа на антительный препарат

Первый этап получения антиидиотипических антител предусматривает иммунизацию линейных мышей конъюгированными препаратами. Для постановки опыта были отобраны 3 группы мышей линии BALB/c.

Первая группа подвергалась иммунизации антительным препаратом, при получении которого в качестве носителя использовалось коллоидное золото. Метод его получения включал в себя смешивание МКА с коллоидным золотом (рН 8-9), после чего добавляли 10% БСА до концентрации 0,25%. Проводили перемешивание в течение 5 минут и удаляли излишки антител методом центрифугирования при 10 тыс об/мин. Полученный осадок растворяли в PBS, содержащего 1% ПЭГ 4000.

Вторую группу мышей иммунизировали препаратом, в котором носителем являлся БСА. Конъюгацию с МКА проводили по следующему принципу: смешивали антитела и БСА в равной концентрации (0,5 мг/мл) и объеме, после чего добавляли 0,05% раствор глютарового альдегида. Полученную смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре и диализовали против PBS.

Мышам контрольной группы вводили буферный раствор.

Схема иммунизации мышей линии BALB/c включала пятикратное введение препарата с полным и неполным адъювантом Фрейда в течение двух недель (таблица 2).

Таблица 2 – Схема иммунизации мышей линии ВАLB/c (по И.И.Фридлянский, 1988)

Введение препаратов проводили внутрибрюшинно по 0,1 мл на голову с неполным и полным адъювантом Фрейда в зависимости от сроков введения. При этом соблюдались все правила асептики (рисунок 3).

Рисунок 3. Иммунизация мышей конъюгированными препаратами

Контроль гибридных клеток на способность выработки специфических антител определяли в сэндвич варианте ИФА с применением антител использованных при получении конъюгированных препаратов.

Иммуноферментный анализ проводили по следующей схеме: МКА штамма гибридных клеток 2F9B11, адсорбировали в ячейках планшета для иммунологических реакций в объеме 0,1 мл, выдерживая в течение ночи при 4°С. Затем ячейки планшета отмывали 3 раза ЗФР с 0,05% содержанием твин-20 и 3 раза ЗФР. Блокировали свободные участки носителя путем внесения в каждую из них 0,1 мл 5% раствора обезжиренного сухого молока и инкубировали планшет 1 час при температуре 37°С. Затем ячейки планшета отмывали 3 раза ЗФР с 0,05% содержанием твин-20 и 3 раза ЗФР. Потом в ячейки вносили образцы ростовой среды гибридных клеток и выдерживали 1 час при 37°С. Ячейки вновь отмывали, а затем вносили раствор специфического конъюгата полученного путем сшивки МКА 2F9B11 с ферментов пероксидазой хрена и инкубировали 1 час при 37°С. Результаты ИФА определяли после отмывки ячеек планшета и добавления в них субстрата фермента – тиаминобензидина (ТМБ). Через 10 минут останавливали реакцию внесением в ячейки 0,1 мл 0,5М серной кислоты.

Результаты ИФА оценивали с помощью фотометра «Expert 96» (Австрия) при длине волны 450 нм.

Положительная реакция характеризовалась окрашиванием жидкости (раствора субстрата) в синий цвет различной интенсивности и в желтый цвет после внесения стоп-реагента (рисунок 4).

Рисунок 4. Результаты тестирования сыворотки мышей на наличие специфического иммунного ответа

В результате проведенной иммунизации титры специфических антител в крови мышей в ИФА составили в первой группе – от 1:400 до 1:800, во второй группе – 1:12800 до 1:25600, в контрольной группе результат был отрицательным (таблица 3).

Таблица 3 – Исследование сывороток крови иммунизированных мышей линии BALB/c в сэндвич варианте ИФА

Данный результат позволил сделать вывод, что наибольший иммунный ответ удается получить при использовании препарата, носителем в котором является бычий сывороточный альбумин.

Для гибридизации использовали селезенки от иммунных мышей с наиболее высокими титрами в ИФА. В нашем случае на слияние отбирались линейные мыши с титром иммунных антител – 1:12800. Всего было проведено две гибридизации клеток миеломной линии Х-63/Ag 8.653 с иммунными лимфоцитами мышей.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: