Определение мочевины в сыворотке крови колориметрическим методом

Примерно 50% небелкового остаточного азота крови приходится на долю мочевины. В норме в сыворотке крови содержание мочевины составляет 3,33-8,32 ммоль /л (20-50мг%).

Мочевина образует с диацетилмонооксимом при наличии тиосемикарбазида и солей железа в сильнокислой среде при нагревании комплекс красного (розово-красного) цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевины в сыворотке крови.

Материалы, реактивы, оборудование.

В случае отсутствия готовых наборов химикатов для определения мочевины по данному методу необходимы следующие реактивы: 10% раствор трихлоруксусной кислоты; стандартный раствор мочевины, 100мг/100мл (готовят на воде или в 0,2% бензойной кислоты); хлорное железо (для определения мочевины), 5% раствор (основной раствор: 5г хлорного железа доводят до объёма 100мл водой, после чего подкисляют 1мл концентрированной H₂SO₄; рабочий раствор доводят до объёма 100 мл дистиллированной водой, добавляют 8 мл концентрированной H₂SO₄ и 1 мл 85% ортофосфорной кислоты; раствор хранят в тёмной посуде); диацетилмонооксим, 2,5% водный раствор; тиосемикарбамид, 0,25% раствор (хранят в темной посуде); цветной реактив хлорида (готовят каждый раз перед употреблением: к 30мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20мл дистиллированной воды, 1мл 2,5% диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25% тиосемикарбамида); центрифужные пробирки; сыворотка крови.

Ход работы.

Для осаждения белков к 0,8 мл воды в центрифужную пробирку добавляют 0,2 мл сыворотки, 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Одновременно в обычной пробирке готовят пробу со стандартным раствором мочевины вместо сыворотки. Через 15 мин пробирку с сывороткой центрифугируют при 1500 об/мин в течении 10 минут. Затем в одну пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, а в другую - 0,5 мл стандартного раствора мочевины. Приливают в каждую пробирку по 5 мл цветного реактива и перемешивают. Помещают пробирки в кипящую водяную баню на 20 мин, затем охлаждают под водопроводной водой 2 -3мин.

Фотометрируют пробу и стандарт при зеленном светофильтре против контроля в кювете на 10 мм. Контрольную пробу ставят также, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл дистиллированной воды.

Расчет мочевины производят по формуле:

где Х - концентрация мочевины (мг/100мл); Е_оп- экстинкция опытной пробы; Е_ст - экстинкция стандартной пробы; 100 - концентрация мочевины, в стандартном растворе (мг/100мл). Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,1665.

Лабораторная работа 3.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: